应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR退火温度设置
101/1返回列表
查看: 2213  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

雪中花sml

新虫 (小有名气)

[求助] PCR退火温度设置 已有7人参与

目前做PCR扩增，由于目的基因（1300bp）前面一段GC含量比较高的问题，设置的两条引物，其中一条GC%为80%，Tm为77.7，另一条GC%为45%，Tm为54.3，以大家的经验觉得用这两条引物扩增目的基因的退火温度应该设置为多少呢
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
向着前方迈进
1楼 2015-02-05 19:17:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
雪中花sml(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-05 22:01:26
为何不缩短上游引物长度，加长下游引物长度，看能否接近点？
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2015-02-05 19:27:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
60度.特异性好的话,退火温度只能排第二.

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2015-02-05 23:14:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chibang1220

木虫 (著名写手)
★
雪中花sml(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-06 20:50:13
为什么要把引物设计成这样？引物长度在25-35bp特异性都是可以的，在这个范围内你可以修改2条引物使其Tm值相近，PCR时选择合适的退火温度。你是不是追求2条引物一样长了啊？而且你目的基因才1300bp我觉得即使引物长度20bp特异性应该也不会太差（个人意见）
赞一下 回复此楼
人的差别在于业余时间
4楼2015-02-06 08:54:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rv1nm2y

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
雪中花sml(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-06 20:50:20
可以设置一个梯度PCR，并且有的时候扩增与退火温度没有太大关系，只要合适区间都可以扩出来。
赞一下 回复此楼
5楼2015-02-06 09:51:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我是钢镚

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
雪中花sml(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-06 20:50:29
可以使用hot phusion hot start DNA polymerase（Thermo）, 退火温度可以比Tm值高3度，而且可以使用高GC buffer，这个酶高保真，而且超快，每Kb只要15s。好运！
赞一下 回复此楼
6楼2015-02-06 11:27:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
雪中花sml(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-06 20:50:36
GC含量这么高，只从退火温度上做改变的话，可能不一定好做，建议也是使用Hot start Taq酶扩增，配合专用的buffer，效果可能不错，个人推荐
赞一下 回复此楼
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
7楼2015-02-06 16:06:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zshw_001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
退火温度太高了吧，试试梯度退火吧。
赞一下 回复此楼
永远相信未知的总是美好的！
8楼2015-02-06 16:31:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linxiqi

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果不知道引物的退火温度，我们就采用降落PCR，我们老师都是这么做的。
赞一下 回复此楼
活在当下
9楼2015-02-06 18:12:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

maila
10楼2015-02-07 19:42:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 雪中花sml 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +9 家与远方 2026-08-10 14/700 2026-08-13 09:41 by 臭臭不臭01
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +22 Lanmanbaby 2026-08-09 36/1800 2026-08-12 22:50 by sdfapple719
[基金申请] filecode +13 documentary 2026-08-10 15/750 2026-08-12 15:56 by 云上清扬
[基金申请] 奇怪，两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +7 布布和一二 2026-08-10 10/500 2026-08-12 09:12 by 布布和一二
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +3 majunge000 2026-08-11 4/200 2026-08-11 20:13 by lch2012
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[硕博家园] 读博的好处 +3 lnee 2026-08-11 3/150 2026-08-11 18:10 by 希望我好好的
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 关于代码变化问题，想知道的进来 +17 且听虎啸 2026-08-07 24/1200 2026-08-10 18:35 by zhangduo2008
[基金申请] 静等基金结果 +5 gjjjzhong 2026-08-10 16/800 2026-08-10 17:19 by Tide man
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +11 布布和一二 2026-08-08 22/1100 2026-08-10 11:10 by wmfsnow
[基金申请] fileCode有新解读？ +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于filecode，很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制，评价高的钱多评价低的钱少，但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变，有变的大神么？ +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭