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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR退火温度设置
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雪中花sml

新虫 (小有名气)

[求助] PCR退火温度设置 已有7人参与

目前做PCR扩增，由于目的基因（1300bp）前面一段GC含量比较高的问题，设置的两条引物，其中一条GC%为80%，Tm为77.7，另一条GC%为45%，Tm为54.3，以大家的经验觉得用这两条引物扩增目的基因的退火温度应该设置为多少呢
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向着前方迈进
1楼 2015-02-05 19:17:27
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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雪中花sml(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-05 22:01:26
为何不缩短上游引物长度，加长下游引物长度，看能否接近点？
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2楼2015-02-05 19:27:37
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
60度.特异性好的话,退火温度只能排第二.

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2015-02-05 23:14:33
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chibang1220

木虫 (著名写手)
★
雪中花sml(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-06 20:50:13
为什么要把引物设计成这样？引物长度在25-35bp特异性都是可以的，在这个范围内你可以修改2条引物使其Tm值相近，PCR时选择合适的退火温度。你是不是追求2条引物一样长了啊？而且你目的基因才1300bp我觉得即使引物长度20bp特异性应该也不会太差（个人意见）
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人的差别在于业余时间
4楼2015-02-06 08:54:34
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rv1nm2y

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
雪中花sml(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-06 20:50:20
可以设置一个梯度PCR，并且有的时候扩增与退火温度没有太大关系，只要合适区间都可以扩出来。
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5楼2015-02-06 09:51:04
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我是钢镚

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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雪中花sml(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-06 20:50:29
可以使用hot phusion hot start DNA polymerase（Thermo）, 退火温度可以比Tm值高3度，而且可以使用高GC buffer，这个酶高保真，而且超快，每Kb只要15s。好运！
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6楼2015-02-06 11:27:33
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
雪中花sml(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-06 20:50:36
GC含量这么高，只从退火温度上做改变的话，可能不一定好做，建议也是使用Hot start Taq酶扩增，配合专用的buffer，效果可能不错，个人推荐
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
7楼2015-02-06 16:06:43
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zshw_001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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退火温度太高了吧，试试梯度退火吧。
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永远相信未知的总是美好的！
8楼2015-02-06 16:31:11
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linxiqi

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果不知道引物的退火温度，我们就采用降落PCR，我们老师都是这么做的。
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活在当下
9楼2015-02-06 18:12:40
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maila
10楼2015-02-07 19:42:24
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