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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR退火温度设置
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雪中花sml

新虫 (小有名气)

[求助] PCR退火温度设置 已有7人参与

目前做PCR扩增，由于目的基因（1300bp）前面一段GC含量比较高的问题，设置的两条引物，其中一条GC%为80%，Tm为77.7，另一条GC%为45%，Tm为54.3，以大家的经验觉得用这两条引物扩增目的基因的退火温度应该设置为多少呢
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向着前方迈进
1楼 2015-02-05 19:17:27
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
雪中花sml(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-06 20:50:36
GC含量这么高，只从退火温度上做改变的话，可能不一定好做，建议也是使用Hot start Taq酶扩增，配合专用的buffer，效果可能不错，个人推荐
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
7楼2015-02-06 16:06:43
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
雪中花sml(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-05 22:01:26
为何不缩短上游引物长度，加长下游引物长度，看能否接近点？
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2楼2015-02-05 19:27:37
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
60度.特异性好的话,退火温度只能排第二.

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2015-02-05 23:14:33
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chibang1220

木虫 (著名写手)
★
雪中花sml(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-06 20:50:13
为什么要把引物设计成这样？引物长度在25-35bp特异性都是可以的，在这个范围内你可以修改2条引物使其Tm值相近，PCR时选择合适的退火温度。你是不是追求2条引物一样长了啊？而且你目的基因才1300bp我觉得即使引物长度20bp特异性应该也不会太差（个人意见）
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人的差别在于业余时间
4楼2015-02-06 08:54:34
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