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qRT-PCR模板量应该加多少？ 已有4人参与
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我模板cDNA不稀释加 2ul，目的基因CT值35,36,37（平行性一点不好）.。。。.β-actin的ct值是18（三个复孔相差0.3以内）. 内参挺好说明不是操作的问题，我在想是不是目的基因表达量低，我应该提高模板量至4ul? 但是，我突然想到是不是我模板量加多了导致目的基因CT值不稳定？请问模板量过高会产生这样的不利影响吗？ 还是说我应该把模板量提高到4ul，6ul试试？ |
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【答案】应助回帖
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空谈误国(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:04:38
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一，ct超过32以上就一般不能使用了，问题可能为目的基因表达太低，你可以用普通pcr检测以下你的摸板，是否有基因表达并且引物是否有dimer。确定过后才可上机。 二，内参的选择，你选择的内参在你的实验里显然已经不太适用了，需要重新选择内参，具体你需要查阅文献了，并不是一个内参用到底，不同的实验有不同的要求，你需要一个表达量低的内参 基因，并且控制你的内参和你的目的基因的ct值在10以内（也就是说一个内参高过20，目的低过30。） 这样数值才可靠。 三，最好不要更改体系，变换摸班浓度以稀释为主，不要增添。 |
4楼2015-01-28 19:04:33
2楼2015-01-28 16:32:59
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6楼2015-05-02 14:15:16
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考虑引物问题，内参跑18说明引物浓度够了，目的跑35+不知道你一共多少个循环，跑到35+很可能目的基因没有扩增，建议用相同的protocol跑一个普通PCR看看有没有条带。如果引物没有问题那很肯能就是该基因不表达。 发自小木虫Android客户端 |
7楼2016-02-14 18:10:29
8楼2016-02-14 18:11:17
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