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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » qRT-PCR模板量应该加多少？
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空谈误国

金虫 (正式写手)

潜龙勿用

[求助] qRT-PCR模板量应该加多少？已有4人参与

我模板cDNA不稀释加 2ul，目的基因CT值35,36,37（平行性一点不好）.。。。.β-actin的ct值是18（三个复孔相差0.3以内）.
内参挺好说明不是操作的问题，我在想是不是目的基因表达量低，我应该提高模板量至4ul?
但是，我突然想到是不是我模板量加多了导致目的基因CT值不稳定？请问模板量过高会产生这样的不利影响吗？
还是说我应该把模板量提高到4ul，6ul试试？
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1楼2015-01-28 14:50:36
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空谈误国

金虫 (正式写手)

潜龙勿用
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-28 16:32:59
你用的试剂说明书上会标明你需要使用多大的模板量的。内参正常，目的基因CT值那么高，有可能就是不表达，也有可能是你探针设计的不好，看一下溶解曲线。或者，你说的模板量。再试吧

谢谢！是引物的问题，我换引物就好了
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6楼2015-05-02 14:15:16
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
空谈误国(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:04:25
你用的试剂说明书上会标明你需要使用多大的模板量的。内参正常，目的基因CT值那么高，有可能就是不表达，也有可能是你探针设计的不好，看一下溶解曲线。或者，你说的模板量。再试吧
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2楼2015-01-28 16:32:59
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空谈误国

金虫 (正式写手)

潜龙勿用
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-28 16:32:59
你用的试剂说明书上会标明你需要使用多大的模板量的。内参正常，目的基因CT值那么高，有可能就是不表达，也有可能是你探针设计的不好，看一下溶解曲线。或者，你说的模板量。再试吧

说明书上模板量写的“Variable”，引物是我师姐从文献里找的，这次提高模板量不行的话，我应该看看引物特异性怎么样。
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3楼2015-01-28 18:17:10
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logowang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
空谈误国(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:04:38
一，ct超过32以上就一般不能使用了，问题可能为目的基因表达太低，你可以用普通pcr检测以下你的摸板，是否有基因表达并且引物是否有dimer。确定过后才可上机。
二，内参的选择，你选择的内参在你的实验里显然已经不太适用了，需要重新选择内参，具体你需要查阅文献了，并不是一个内参用到底，不同的实验有不同的要求，你需要一个表达量低的内参 基因，并且控制你的内参和你的目的基因的ct值在10以内（也就是说一个内参高过20，目的低过30。） 这样数值才可靠。

三，最好不要更改体系，变换摸班浓度以稀释为主，不要增添。
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4楼2015-01-28 19:04:33
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