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艰苦温度

新虫 (小有名气)

[求助] PCR目的片段两端GC含量严重不平衡导致片段扩增不出来 已有5人参与

PCR目的片段两端GC含量严重不平衡导致片段扩增不出来
3‘端的TA特别多,30bp片段的GC含量只有15%

各位有没有遇到类似问题的?怎么解决啊?
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
艰苦温度(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-23 21:49:07
如果不是严格要求到某个位置,可以适当放宽到UTR区设计下游引物。
2楼2015-01-23 14:29:47
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
艰苦温度(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-23 21:49:16
下游加长片段长度,下游40BP,上游20左右,让他们退火温度一致。并在下游加兼并引物。
采菊东篱下,悠然见南山。
3楼2015-01-23 14:51:29
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zshw_001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我就是把目的片段向两侧延长,使碱基均衡一些
永远相信未知的总是美好的!
4楼2015-01-23 17:49:57
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卢家彬

木虫 (小有名气)

★
艰苦温度(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-23 21:49:39
换酶可以的,比如KOD FX,我的一条引物GC含量貌似百分之七十多,另一条百分之六十,照样P出来

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2015-01-23 17:58:15
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
touch down pcr试试
6楼2015-01-23 21:33:20
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艰苦温度

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 781055707 at 2015-01-23 14:51:29
下游加长片段长度,下游40BP,上游20左右,让他们退火温度一致。并在下游加兼并引物。

兼并引物没有设计过 能不能稍微详细点介绍下~
7楼2015-01-24 20:38:34
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

呵呵,先不要考虑那么复杂的,GC含量不均衡,就是困难模板啊,用好一点的酶扩增试试看,热启动Taq酶或者是稍具保真度的酶,看GC含量普通Taq酶肯定是不行的,行不通再考虑其他方面(要进行大的改动),先从最简单的开始。http://www.detaibio.com/relia-hotstart-polymerase.html
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
8楼2015-01-27 10:40:59
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