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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR目的片段两端GC含量严重不平衡导致片段扩增不出来
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艰苦温度

新虫 (小有名气)

[求助] PCR目的片段两端GC含量严重不平衡导致片段扩增不出来 已有5人参与

PCR目的片段两端GC含量严重不平衡导致片段扩增不出来
3‘端的TA特别多，30bp片段的GC含量只有15%

各位有没有遇到类似问题的？怎么解决啊？
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1楼 2015-01-23 13:48:36
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
艰苦温度(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-23 21:49:07
如果不是严格要求到某个位置，可以适当放宽到UTR区设计下游引物。
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2楼2015-01-23 14:29:47
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
艰苦温度(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-23 21:49:16
下游加长片段长度，下游40BP，上游20左右，让他们退火温度一致。并在下游加兼并引物。
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采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2015-01-23 14:51:29
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zshw_001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我就是把目的片段向两侧延长，使碱基均衡一些
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永远相信未知的总是美好的！
4楼2015-01-23 17:49:57
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卢家彬

木虫 (小有名气)
★
艰苦温度(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-23 21:49:39
换酶可以的，比如KOD FX，我的一条引物GC含量貌似百分之七十多，另一条百分之六十，照样P出来

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2015-01-23 17:58:15
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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touch down pcr试试
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6楼2015-01-23 21:33:20
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艰苦温度

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 781055707 at 2015-01-23 14:51:29
下游加长片段长度，下游40BP，上游20左右，让他们退火温度一致。并在下游加兼并引物。

兼并引物没有设计过 能不能稍微详细点介绍下～
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7楼2015-01-24 20:38:34
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

呵呵，先不要考虑那么复杂的，GC含量不均衡，就是困难模板啊，用好一点的酶扩增试试看，热启动Taq酶或者是稍具保真度的酶，看GC含量普通Taq酶肯定是不行的，行不通再考虑其他方面（要进行大的改动），先从最简单的开始。http://www.detaibio.com/relia-hotstart-polymerase.html
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
8楼2015-01-27 10:40:59
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