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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » His- tag纯化蛋白，柱子挂不上的问题
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zhjzhou

木虫 (著名写手)

[求助] His- tag纯化蛋白，柱子挂不上的问题 已有4人参与

看到论坛里有很多这方面的问题，也把我的问题放这儿和大家讨论下，请达人们给点指导。我这个蛋白已经诱导出来是可溶性的，就是过柱子的时候都没有挂柱子上，都到flow-through里了，这个怎么解决啊？诱导图片第三道是诱导的目的蛋白，大小在35KD上面一点，纯化后就什么都没有了。

His- tag纯化蛋白，柱子挂不上的问题
诱导图片.jpg


His- tag纯化蛋白，柱子挂不上的问题-1
纯化图片.jpg
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1楼 2015-01-22 14:49:32
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ptttmt

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhjzhou: 金币+2, ★有帮助, 谢谢！ 2015-01-22 15:50:21
His标签在哪一端？N端？C端？中间？是否容易暴露及延伸出来？可以对融合蛋白进行模建，看看his标签的展示情况。你还可以试一下在破碎液中加入终浓度2M尿素，再挂柱纯化试试；若2M还是纯化不到，加入终浓度8M尿素再纯化试试。
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2楼2015-01-22 15:35:03
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zhjzhou

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ptttmt at 2015-01-22 15:35:03
His标签在哪一端？N端？C端？中间？是否容易暴露及延伸出来？可以对融合蛋白进行模建，看看his标签的展示情况。你还可以试一下在破碎液中加入终浓度2M尿素，再挂柱纯化试试；若2M还是纯化不到，加入终浓度8M尿素再纯 ...

用的是pet28a载体，His-tag在前面，我这个是可溶性蛋白，要加尿素吗？
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3楼2015-01-22 15:50:01
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ptttmt

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zhjzhou at 2015-01-22 15:50:01
用的是pet28a载体，His-tag在前面，我这个是可溶性蛋白，要加尿素吗？...

把你的纯化溶液和步骤发上来看看，关键是washing buffer里面咪唑的浓度，看你这图片，一点都没有挂上的感觉，这不应该啊，多多少少应该有点才对
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4楼2015-01-22 17:39:53
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loveqiuqiu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
使用washing buffer  和不同浓度的咪唑溶液依次洗脱，最后的strip 也要留下 ，左右洗脱液都跑一下，如果都没有的话那是根本没有洗脱下来吧
我每次用的依次为 washing buffer开始1ml、washing buffer结束前1ml，咪唑浓度200 3ml、 400 2ml 、600 2ml、800、 1000、strip buffer各1ml     每1ml接1个EP中，各样品都跑一下 基本都是会出现条带的   
希望能帮助到你
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5楼2015-01-23 00:27:52
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pnkyh

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
其它人用这柱料时有出现这问题吗，还可以调一下裂解液的pH
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6楼2015-01-23 11:00:43
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lxgnh166

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你这个可能表达是标签被包裹，你可以尝试较高的PH，或者在上样是加点氯化钠，用PBS缓冲液试下。
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7楼2015-01-30 14:40:33
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