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jezo_

新虫 (初入文坛)

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[求助] 蛋白总是不表达已有1人参与

最近做蛋白总是不表达，都是构建PET28a上的
有几个是以前构建好的载体，一直表达都很好，做小量诱导时也是正常的，扩大后就不表达了，之后重新做了几次转化，BL21、Rosseta都试过了，对菌体做PCR目的片段也还在，但就是没有表达
新构建的几个也是没有表达
菌体感觉也是正常的，IPTG、乳糖诱导都试过
因为是很多个蛋白都这样，请各位大神指点一下有可能是什么原因

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1楼 2015-01-20 14:51:18

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董博士

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【答案】应助回帖

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1、从NCBI上下载的序列是否经过优化？有些密码子并不适合在原核表达系统中表达。
2、如果密码子优化过了，那么表达载体也会影响目的蛋白的表达。如果PET28a的表达一直做不出来，建议换一种表达载体；
3、也有可能是宿主菌的问题，尝试下其他的感受态；
4、诱导条件优化，诱导剂的量，诱导表达的温度和时间，设置梯度进行实验。