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兰舍难分

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于融合PCR已有4人参与

我现在正在做，也设计了两对引物，中间的重复的碱基有700多bp，请问这样能做成功吗？对结果有影响吗？
望做过的大神指点一下
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1楼2015-01-19 13:23:22
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titus0805

铁虫 (小有名气)
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是重叠pcr吗？重复的碱基有700多？为什么？
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2楼2015-01-19 13:32:45
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兰舍难分

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by titus0805 at 2015-01-19 13:32:45
是重叠pcr吗？重复的碱基有700多？为什么？

我原本克隆的基因是3000多bp，之前用一对引物总是克不出来（可能有些长了的原因），现在准备用重叠互补融合PCR方法来克隆，将这个目的基因从中间分成两段来克隆，我设计的两对引物就是这样的，第一对下游跟第二对的上游之间的重叠部分有700bp，想问一下这样会不会做不出来，或是有影响啊？
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3楼2015-01-19 13:56:49
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-01-26 10:01:54
3000bp不算长啊 ,扩增不出来？我想可能是酶的原因，普通的Taq酶可能扩增不了，换成热启动Taq酶，3000bp的也见不着用长片段酶扩增，大于10kb的采用长片段酶扩增，小于10kb的热启动Taq酶足够扩增出来http://www.detaibio.com/relia-hotstart-polymerase.html
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-01-20 08:51:34
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)
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overlapping pcr，重复20bp足矣。

不知道是不是越多越好
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做一个阳光、开朗的小和尚
5楼2015-01-20 12:18:58
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781055707

木虫 (著名写手)
★
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楼主，你这是要把3000全P出来吧，两个目的片段700多重复干什么，（重复20bp足矣）楼上的说的对，把两片段放一起，在加一对引物就行了，貌似700多你可以试一试，古今怕是第一人了。能P出来的话，忘楼主告知一下哦。
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采菊东篱下，悠然见南山。
6楼2015-01-21 13:33:29
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兰舍难分

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-01-20 08:51:34
3000bp不算长啊 ,扩增不出来？我想可能是酶的原因，普通的Taq酶可能扩增不了，换成热启动Taq酶，3000bp的也见不着用长片段酶扩增，大于10kb的采用长片段酶扩增，小于10kb的热启动Taq酶足够扩增出来http://www.detai ...

我第一次用普通酶克出来过一次，可是到后面在用同样条件扩增时却怎么都克不出来了！很是郁闷。。。热启动Taq酶？我用的一般是rTaq酶和EXrTaq酶。。。
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7楼2015-01-25 22:26:58
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
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引用回帖:
7楼: Originally posted by 兰舍难分 at 2015-01-25 22:26:58
我第一次用普通酶克出来过一次，可是到后面在用同样条件扩增时却怎么都克不出来了！很是郁闷。。。热启动Taq酶？我用的一般是rTaq酶和EXrTaq酶。。。...

热启动Taq酶，就是温度达到95摄氏度了，酶活才能启动，PCR才能扩增，这就避免了在预变性或者在我们配置反应体系的时候酶就发挥活性，导致引物二聚体或者其他非特异性条带产生。
TAKAR 的rTaq酶就是普通的Taq酶啊，EXrTaq酶就是稍具保真性的普通Taq酶（可以说是一般的保真酶吧，呵呵）。rTaq扩增不出来很正常的，相反的如果不是对扩增要求十分精确如突变检测等（涉及到一个碱基的），不建议使用保真性的酶，它具有保真性可以切掉你错配的碱基同样也可能会将你的模板（引物）降解掉，导致什么都扩增不出来。所以，一般PCR热启动酶足够了，不会产生二聚体也不会降解模板或是引物。http://www.detaibio.com/relia-hotstart-polymerase.html第一段有原理，
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
8楼2015-01-26 10:50:42
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