| 查看: 5977 | 回复: 7 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
请教关于qRT-PCR对照设置的一些问题
|
|||
|
本人近期准备做qRT-PCR,看了一些相关资料，但是对于试验中对照设置的问题还是有些不太明白， 具体问题为：1.在合成cDNA的过程中，（1）对于阴性对照，有的说是每对引物设不加模板的对照，还有的说是每个样品设不加逆转录酶的对照，究竟应该怎么设呢？（2）这些对照每次试验都要设吗？（3）还有阳性对照怎么设，每个样品用内参引物进行反转录就是阳性对照吗？ 2.在以cDNA为模板进行定量PCR时，阳性对照和阴性对照又应该如何设置？ 还请了解qRT-PCR的前辈们不吝赐教,不胜感激！ |
回复此楼» 猜你喜欢
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有80人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 判断引物是否适合用于qRT-PCR
已经有4人回复
- 基因组PCR用于验证RT-PCR引物的实验思路，请大虾们把把关
已经有21人回复
- 求助关于QRT-PCR数据处理问题！
已经有11人回复
- 荧光定量PCR中，结果内参基因的CT值有，但是目的基因的CT值没有，怎么办
已经有20人回复
- RT-PCR过程中内参基因CT值问题
已经有6人回复
- 请问qRT-PCR的标准曲线中扩增效率过高是怎么回事
已经有8人回复
- RT-PCR, q-PCR, 和qRT-PCR的引物可以相同吗？
已经有3人回复
- 关于QRT-PCR样本处理
已经有4人回复
- 新人做qRT-PCR 引物怎么设计？
已经有5人回复
- 求助：相对定量qRT-PCR，需要定量mRNA或者cDNA吗？
已经有4人回复
- 求高手推荐qRT-PCR数据分析和作图的R的包
已经有6人回复
- 如何回复审稿人意见
已经有17人回复
- 关于qRT-PCR内参基因的验证
已经有10人回复
- 相对定量PCR对照组的bar问题，急求解答，在线等！
已经有14人回复
- Realtime PCR 内参与目的基因问题
已经有11人回复
- qRT-PCR的数据处理问题，error bar应该怎么做？
已经有4人回复
- Q-PCR和RT-PCR结果不一致呢？
已经有3人回复
- RT-qPCR实验问题
已经有23人回复
- 一个关于qPCR标准曲线的问题。谢谢！
已经有12人回复
- 向RTPCR高手求助，关于RTPCR的空白对照问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】qrt-pcr引物是否要纯化
已经有4人回复
- 【求助/交流】qRT-PCR
已经有16人回复
- 【求助/交流】关于PCR的问题
已经有18人回复
- 【求助/交流】qRT-PCR需要做不加RT的对照吗？
已经有3人回复
阿Q~~
至尊木虫 (文坛精英)
- 应助: 77 (初中生)
- 金币: 33343.6
- 红花: 107
- 帖子: 36186
- 在线: 1028.1小时
- 虫号: 3237212
- 注册: 2014-05-27
- 性别: MM
- 专业: 宇宙学
7楼2014-12-29 07:59:43
dongrh1981
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 15 (小学生)
- 金币: 1036.1
- 红花: 3
- 帖子: 695
- 在线: 92.5小时
- 虫号: 809546
- 注册: 2009-07-15
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xiaoyund1: 金币+5 2014-12-28 17:53:48
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xiaoyund1: 金币+5 2014-12-28 17:53:48
|
严谨的讲，每次试验都要带一个阳性对照和一个阴性对照，阳性用来测试你配制的PCR体系是否漏加或错加组分，阴性用来判读你的真个PCR试验过程是否存在污染。阴性对照是指不加模板，用于环境中是否存在PCR扩增产物污染，也可用于观察设计的引物是否有二聚体；阳性对照是用来判断你设计的引物是否能够扩增出正确的PCR片段，如果用actin而不是靶标引物做阳性对照的话，actin出来了而样品没出来的话，你无法判断是你的体系少加了组分还是你的引物设计不合理。上述对照既适用于逆转录也适用于DNA样品的PCR扩增。 不知道你试验的目的，不过做人源RNA的逆转录一般都用6随机碱基引物或者oligo dT引物，这样得到的cDNA能用于任何一个靶标基因的后续操作。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
xiaoyund12楼2014-12-26 21:05:15
4楼2014-12-28 17:51:59
dongrh1981
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 15 (小学生)
- 金币: 1036.1
- 红花: 3
- 帖子: 695
- 在线: 92.5小时
- 虫号: 809546
- 注册: 2009-07-15
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xiaoyund1: 金币+5 2014-12-31 10:25:41
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xiaoyund1: 金币+5 2014-12-31 10:25:41
|
不用专门针对每个体系做不加逆转录的对照，只需要在提取时加入DNase消化基因组DNA就行，商品化得试剂盒基本都有这一步，如果是自己DIY的RNA提取试剂的话，那就跑下电泳，看有没有基因组DNA污染；另外，检测转录水平的试验引物都设计在跨外显子区域，就算有基因组DNA污染也是没有办法扩出来的，除非引物设计不合理或者用的是sybr Green法，如果用sybr Green法的话，建议用商品化试剂盒提RNA，DIY的试剂就买点DNase回来，摸索下用量就行，不加逆转录酶做对照不能解决基因组DNA污染问题。 RNA存在一定程度讲解，但如果提取到的量足够并能及时放入-80冰箱，应该不会讲解多少，当然，最好是现提现用，并且严格控制好RNA质量和所设计好的引物，所以你需要先把提取方案设计或优化好，同时做之前对引物做些评价，后续试验就能一气呵成，不然后面得不到好的数据，或者数据一团糟分析不出结论。 |
6楼2014-12-29 00:14:58
30