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请教关于qRT-PCR对照设置的一些问题
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本人近期准备做qRT-PCR,看了一些相关资料，但是对于试验中对照设置的问题还是有些不太明白， 具体问题为：1.在合成cDNA的过程中，（1）对于阴性对照，有的说是每对引物设不加模板的对照，还有的说是每个样品设不加逆转录酶的对照，究竟应该怎么设呢？（2）这些对照每次试验都要设吗？（3）还有阳性对照怎么设，每个样品用内参引物进行反转录就是阳性对照吗？ 2.在以cDNA为模板进行定量PCR时，阳性对照和阴性对照又应该如何设置？ 还请了解qRT-PCR的前辈们不吝赐教,不胜感激！ |
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dongrh1981
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xiaoyund1: 金币+5 2014-12-28 17:53:48
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严谨的讲，每次试验都要带一个阳性对照和一个阴性对照，阳性用来测试你配制的PCR体系是否漏加或错加组分，阴性用来判读你的真个PCR试验过程是否存在污染。阴性对照是指不加模板，用于环境中是否存在PCR扩增产物污染，也可用于观察设计的引物是否有二聚体；阳性对照是用来判断你设计的引物是否能够扩增出正确的PCR片段，如果用actin而不是靶标引物做阳性对照的话，actin出来了而样品没出来的话，你无法判断是你的体系少加了组分还是你的引物设计不合理。上述对照既适用于逆转录也适用于DNA样品的PCR扩增。 不知道你试验的目的，不过做人源RNA的逆转录一般都用6随机碱基引物或者oligo dT引物，这样得到的cDNA能用于任何一个靶标基因的后续操作。 |
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xiaoyund1
2楼2014-12-26 21:05:15
mzhyan
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dongrh1981
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xiaoyund1: 金币+5 2014-12-31 10:25:41
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xiaoyund1: 金币+5 2014-12-31 10:25:41
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不用专门针对每个体系做不加逆转录的对照，只需要在提取时加入DNase消化基因组DNA就行，商品化得试剂盒基本都有这一步，如果是自己DIY的RNA提取试剂的话，那就跑下电泳，看有没有基因组DNA污染；另外，检测转录水平的试验引物都设计在跨外显子区域，就算有基因组DNA污染也是没有办法扩出来的，除非引物设计不合理或者用的是sybr Green法，如果用sybr Green法的话，建议用商品化试剂盒提RNA，DIY的试剂就买点DNase回来，摸索下用量就行，不加逆转录酶做对照不能解决基因组DNA污染问题。 RNA存在一定程度讲解，但如果提取到的量足够并能及时放入-80冰箱，应该不会讲解多少，当然，最好是现提现用，并且严格控制好RNA质量和所设计好的引物，所以你需要先把提取方案设计或优化好，同时做之前对引物做些评价，后续试验就能一气呵成，不然后面得不到好的数据，或者数据一团糟分析不出结论。 |
6楼2014-12-29 00:14:58
阿Q~~
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