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dazhen9527

新虫 (小有名气)

[交流] 蛋白纯化有杂带 已有2人参与

目的蛋白83KDa,C端his标签,镍柱纯化过程中,总是在37KDa处伴随一条很亮的杂带,用的BL21表达菌株,pET28a表达载体!请大家多指教!

蛋白纯化有杂带
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justdoit
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dazhen9527

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 董博士 at 2014-12-28 21:49:17
这个之前我也遇到过,我后来重新用异丙醇以及酒精清洗了柱子,重新摇了菌,并在诱导条件方面控制都很严格,然后10ul上样,1RPM过柱,再用50nM咪唑清洗,6RPM, 之前就是数值一直不变,这次数值变化很大,先增后降, ...

谢谢您的详尽回复,我想了解一下出现这种原因,是因为被蛋白酶切割了,还是杂蛋白没去除干净,从图来看,下面的蛋白好像是伴随着上面的目的蛋白一起出现的,好像降解似的
justdoit
8楼2014-12-29 16:08:41
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lpzl

木虫 (正式写手)

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
请问下楼主,这是摇菌多少体积纯化的?上样量是多少?表达的蛋白是否为包涵体?
Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
4楼2014-12-26 09:04:57
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dazhen9527

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lpzl at 2014-12-26 09:04:57
请问下楼主,这是摇菌多少体积纯化的?上样量是多少?表达的蛋白是否为包涵体?

妖菌100ml,跑电泳上样量10ul,蛋白浓度约为400ug/ml,蛋白可溶
justdoit
5楼2014-12-26 09:12:58
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天际雾影

新虫 (小有名气)

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你可以先用50mM的咪唑洗一下,在用500mM洗脱目的蛋白,可以试试效果。如果杂带减少,还没消失可以再增加一次100mM咪唑洗杂带。
6楼2014-12-28 20:24:42
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