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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 蛋白纯化有两条杂带一直去不掉……
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ylz2433

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化有两条杂带一直去不掉…… 已有4人参与

我的蛋白是His标签，大约93kDa，在纯化的时候在目的蛋白下面一直有两条带去不掉，试了很多条件，像加PMSF、Tween-20、不同浓度NaCl、不同缓冲液、不同pH过Ni柱、过完Ni柱后过Q柱、过完Q柱后过Ni柱，都没什么效果。希望大神赐教啊。最上面的带是我的目的蛋白

蛋白纯化有两条杂带一直去不掉……
1.jpg
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努力，加油！
1楼 2014-10-24 17:10:30
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果你有在his和蛋白之间加蛋白酶如tev，这样过完第一步ni后用tev_his酶切过夜，第二天再过ni柱，收集流穿或低咪唑组分。。。这样可以试试

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4楼2014-10-24 21:04:01
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by ylz2433 at 2014-10-27 10:14:51
我跑native-page的时候只有一条带，所以可以确定杂带不是结合在ni柱上……我用过Qsepharose FF，没什么效果……...

不知道是什么蛋白 ，native一条带的话应该是复合体。或者是分子伴侣。

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8楼2014-10-27 10:57:04
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普通回帖

lpzl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我的也有。。。可能是蛋白讲解吧？楼主纯化后下步实验是啥？若要求不高的话，可以继续往下做
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Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
2楼2014-10-24 17:24:15
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ylz2433

新虫 (小有名气)
加了蛋白酶抑制剂PMSF1mM、0.1mM哦，从一开始纯这个酶各种条件下一直有这两条杂带，，，必须得是纯的蛋白才能往下做呢，，，

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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努力，加油！
3楼2014-10-24 18:16:44
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ylz2433

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by myheat at 2014-10-24 21:04:01
如果你有在his和蛋白之间加蛋白酶如tev，这样过完第一步ni后用tev_his酶切过夜，第二天再过ni柱，收集流穿或低咪唑组分。。。这样可以试试

这个是什么原理呢？
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努力，加油！
5楼2014-10-25 17:02:50
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by ylz2433 at 2014-10-25 17:02:50
这个是什么原理呢？...

那两条咋带肯与ni柱非特异结合，伴随着洗脱一起被纯化。reload ni 就可以去掉。或者得用高分辨率的离子交换如source15q 或monoq分离

[ 发自小木虫客户端 ]
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6楼2014-10-25 18:11:24
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ylz2433

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by myheat at 2014-10-25 18:11:24
那两条咋带肯与ni柱非特异结合，伴随着洗脱一起被纯化。reload ni 就可以去掉。或者得用高分辨率的离子交换如source15q 或monoq分离
...

我跑native-page的时候只有一条带，所以可以确定杂带不是结合在ni柱上……我用过Qsepharose FF，没什么效果……
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努力，加油！
7楼2014-10-27 10:14:51
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wanglele87

金虫 (著名写手)
切标签反挂镍柱。
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一生不羁放纵爱自由
9楼2014-10-28 13:17:05
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ylz2433

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wanglele87 at 2014-10-28 13:17:05
切标签反挂镍柱。

切完标签还能挂上NI柱吗？
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努力，加油！
10楼2014-11-02 19:20:57
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