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ylz2433

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化有两条杂带一直去不掉……已有4人参与

我的蛋白是His标签,大约93kDa,在纯化的时候在目的蛋白下面一直有两条带去不掉,试了很多条件,像加PMSF、Tween-20、不同浓度NaCl、不同缓冲液、不同pH过Ni柱、过完Ni柱后过Q柱、过完Q柱后过Ni柱,都没什么效果。希望大神赐教啊。最上面的带是我的目的蛋白

蛋白纯化有两条杂带一直去不掉……
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
如果你有在his和蛋白之间加蛋白酶如tev,这样过完第一步ni后用tev_his酶切过夜,第二天再过ni柱,收集流穿或低咪唑组分。。。这样可以试试

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2014-10-24 21:04:01
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by ylz2433 at 2014-10-27 10:14:51
我跑native-page的时候只有一条带,所以可以确定杂带不是结合在ni柱上……我用过Qsepharose FF,没什么效果……...

不知道是什么蛋白 ,native一条带的话应该是复合体。或者是分子伴侣。

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-10-27 10:57:04
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普通回帖

lpzl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我的也有。。。可能是蛋白讲解吧?楼主纯化后下步实验是啥?若要求不高的话,可以继续往下做
Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
2楼2014-10-24 17:24:15
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ylz2433

新虫 (小有名气)

加了蛋白酶抑制剂PMSF1mM、0.1mM哦,从一开始纯这个酶各种条件下一直有这两条杂带,,,必须得是纯的蛋白才能往下做呢,,,

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2014-10-24 18:16:44
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ylz2433

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by myheat at 2014-10-24 21:04:01
如果你有在his和蛋白之间加蛋白酶如tev,这样过完第一步ni后用tev_his酶切过夜,第二天再过ni柱,收集流穿或低咪唑组分。。。这样可以试试

这个是什么原理呢?
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5楼2014-10-25 17:02:50
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by ylz2433 at 2014-10-25 17:02:50
这个是什么原理呢?...

那两条咋带肯与ni柱非特异结合,伴随着洗脱一起被纯化。reload ni 就可以去掉。或者得用高分辨率的离子交换如source15q 或monoq分离

[ 发自小木虫客户端 ]
6楼2014-10-25 18:11:24
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ylz2433

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by myheat at 2014-10-25 18:11:24
那两条咋带肯与ni柱非特异结合,伴随着洗脱一起被纯化。reload ni 就可以去掉。或者得用高分辨率的离子交换如source15q 或monoq分离
...

我跑native-page的时候只有一条带,所以可以确定杂带不是结合在ni柱上……我用过Qsepharose FF,没什么效果……
努力,加油!
7楼2014-10-27 10:14:51
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wanglele87

金虫 (著名写手)

切标签反挂镍柱。
一生不羁放纵爱自由
9楼2014-10-28 13:17:05
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ylz2433

新虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by wanglele87 at 2014-10-28 13:17:05
切标签反挂镍柱。

切完标签还能挂上NI柱吗?
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10楼2014-11-02 19:20:57
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