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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 用于连接的目的片段进行了去磷酸化怎么办
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小獠牙

新虫 (初入文坛)

[求助] 用于连接的目的片段进行了去磷酸化怎么办 已有3人参与

我将载体和目的片段分别双酶切之后，又分别都加了CIP去磷酸化一小时，但实际上应该只去磷酸化载体，现在我能否直接进行连接？或者有什么办法能恢复目的片段的5'端磷酸基团？
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1楼 2014-12-17 20:22:09
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-18 16:32:24
还是建议你再重做一次酶切吧！！话说：你的载体和目的片段都是双酶切的，没必要去磷酸化吧，一般只有单酶切的时候载体才有必要去磷酸化。
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2楼2014-12-18 13:17:24
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Beryl_xu

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-18 16:32:33
重新做酶切。为何要去磷酸化，我之前没有这一步哟！
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3楼2014-12-18 13:53:24
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
同楼上
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4楼2014-12-18 14:54:56
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gangouyang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小獠牙: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-12-19 10:29:21
2楼的，注意一下啊，楼主用了同尾酶的话，就需要把载体去磷酸化防止自连。
建议楼主重新准备目的片段，切好了直接纯化后，做连接。
如果去做恢复目的片段的5'端磷酸基团，属于吃力不讨好的事情。
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5楼2014-12-18 17:22:40
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gangouyang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by gangouyang at 2014-12-18 17:22:40
2楼的，注意一下啊，楼主用了同尾酶的话，就需要把载体去磷酸化防止自连。
建议楼主重新准备目的片段，切好了直接纯化后，做连接。
如果去做恢复目的片段的5'端磷酸基团，属于吃力不讨好的事情。

补充一下，两个平末端的酶，载体也是需要去磷酸化的，平末端会自连。
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6楼2014-12-18 22:42:19
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小獠牙

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gangouyang at 2014-12-18 17:22:40
2楼的，注意一下啊，楼主用了同尾酶的话，就需要把载体去磷酸化防止自连。
建议楼主重新准备目的片段，切好了直接纯化后，做连接。
如果去做恢复目的片段的5'端磷酸基团，属于吃力不讨好的事情。

谢谢你哈，我会重新做酶切的。

主要是现在PCR突然又P不出来了，明明还是用同样的体系
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7楼2014-12-19 10:30:31
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xdd1029

铜虫 (初入文坛)
用 T4 PNK的酶就可以再加上磷酸基团
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8楼2014-12-19 20:43:09
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