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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 询问 去磷酸化的问题及怎么处理
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

[求助] 询问 去磷酸化的问题及怎么处理

现有一个麻烦的问题
选用的内切酶是Xho 1  和 BamH 1  
看宝生物的那个书上说是Xho1 必须使用平滑末端的连接条件才可以连上
但是我不知道什么叫平滑末端的连接条件
意思是我用这两个酶从T载体上切下来目的片段和用这两个酶切好的表达载体 不能直接连吗？那要怎么处理一下呢？处理目的片段还是载体？具体是怎么回事  怎么弄得糊里糊涂
所以麻烦知情人士帮忙解释一下这其中的原理，以及后续应该怎么做
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1楼 2012-11-22 09:42:44
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蛋白之家: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-11-22 15:07:54
这里不涉及什么平滑末端啊，XhoI是一个粘性末端的酶啊，具体连接就是将你目标片段用XhoI--BamHI切，载体也用XhoI--BamHI切，然后连接，而且用不到去磷酸化这一步
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2楼2012-11-22 10:57:09
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2012-11-22 10:57:09
这里不涉及什么平滑末端啊，XhoI是一个粘性末端的酶啊，具体连接就是将你目标片段用XhoI--BamHI切，载体也用XhoI--BamHI切，然后连接，而且用不到去磷酸化这一步

我也是觉得用不着去磷酸化   是那个宝生物的目录书上说的 Xho1粘性末端连接条件没有平滑末端连接条件连接效率高
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3楼2012-11-22 11:47:45
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gyesang

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【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 蛋白之家 at 2012-11-22 11:47:45
我也是觉得用不着去磷酸化   是那个宝生物的目录书上说的 Xho1粘性末端连接条件没有平滑末端连接条件连接效率高...

只要把载体酶切干净，片段酶切下来，连接不是问题啊，不用考虑连接效率的问题，不知道你连接用的是什么酶，现在连接的产品也很多，有T4连接酶连接，我们现在用的toyobo的ligation high，16度连接30min就可以转化了
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4楼2012-11-22 12:28:24
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song1205

金虫 (正式写手)
学习了！
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我来了！你在哪儿！
5楼2012-11-22 12:35:39
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2012-11-22 12:28:24
只要把载体酶切干净，片段酶切下来，连接不是问题啊，不用考虑连接效率的问题，不知道你连接用的是什么酶，现在连接的产品也很多，有T4连接酶连接，我们现在用的toyobo的ligation high，16度连接30min就可以转化了...

我们实验室都用的Katara的内切酶和连接酶   再贵的都基本不敢买  没钱呐  这次谢谢你了
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6楼2012-11-22 15:07:06
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diandong

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
7楼2012-11-22 16:31:45
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zhangj0754

木虫 (小有名气)
这两个酶我用过，可以直接连的，１６度过夜就可以连上，没问题的
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8楼2012-11-23 10:11:24
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhangj0754 at 2012-11-23 10:11:24
这两个酶我用过，可以直接连的，１６度过夜就可以连上，没问题的

嗯 好  我试试  谢谢
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9楼2012-11-24 11:00:59
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tj2012

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhangj0754 at 2012-11-23 10:11:24
这两个酶我用过，可以直接连的，１６度过夜就可以连上，没问题的

酶的最适温度不是37℃吗？
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10楼2012-11-24 14:33:52
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