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蛋白之家

新虫 (小有名气)

[求助] 询问 去磷酸化的问题及怎么处理

现有一个麻烦的问题
选用的内切酶是Xho 1  和 BamH 1  
看宝生物的那个书上说是Xho1 必须使用平滑末端的连接条件才可以连上
但是我不知道什么叫平滑末端的连接条件
意思是我用这两个酶从T载体上切下来目的片段和用这两个酶切好的表达载体 不能直接连吗?那要怎么处理一下呢?处理目的片段还是载体?具体是怎么回事  怎么弄得糊里糊涂
所以麻烦知情人士帮忙解释一下这其中的原理,以及后续应该怎么做
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
蛋白之家: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-11-22 15:07:54
这里不涉及什么平滑末端啊,XhoI是一个粘性末端的酶啊,具体连接就是将你目标片段用XhoI--BamHI切,载体也用XhoI--BamHI切,然后连接,而且用不到去磷酸化这一步
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2012-11-22 10:57:09
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2012-11-22 10:57:09
这里不涉及什么平滑末端啊,XhoI是一个粘性末端的酶啊,具体连接就是将你目标片段用XhoI--BamHI切,载体也用XhoI--BamHI切,然后连接,而且用不到去磷酸化这一步

我也是觉得用不着去磷酸化   是那个宝生物的目录书上说的 Xho1粘性末端连接条件没有平滑末端连接条件连接效率高
3楼2012-11-22 11:47:45
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gyesang

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【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 蛋白之家 at 2012-11-22 11:47:45
我也是觉得用不着去磷酸化   是那个宝生物的目录书上说的 Xho1粘性末端连接条件没有平滑末端连接条件连接效率高...

只要把载体酶切干净,片段酶切下来,连接不是问题啊,不用考虑连接效率的问题,不知道你连接用的是什么酶,现在连接的产品也很多,有T4连接酶连接,我们现在用的toyobo的ligation high,16度连接30min就可以转化了
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2012-11-22 12:28:24
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song1205

金虫 (正式写手)

学习了!
我来了!你在哪儿!
5楼2012-11-22 12:35:39
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2012-11-22 12:28:24
只要把载体酶切干净,片段酶切下来,连接不是问题啊,不用考虑连接效率的问题,不知道你连接用的是什么酶,现在连接的产品也很多,有T4连接酶连接,我们现在用的toyobo的ligation high,16度连接30min就可以转化了...

我们实验室都用的Katara的内切酶和连接酶   再贵的都基本不敢买  没钱呐  这次谢谢你了
6楼2012-11-22 15:07:06
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diandong

禁虫 (著名写手)

本帖内容被屏蔽

7楼2012-11-22 16:31:45
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zhangj0754

木虫 (小有名气)

这两个酶我用过,可以直接连的,16度过夜就可以连上,没问题的
8楼2012-11-23 10:11:24
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by zhangj0754 at 2012-11-23 10:11:24
这两个酶我用过,可以直接连的,16度过夜就可以连上,没问题的

嗯 好  我试试  谢谢
9楼2012-11-24 11:00:59
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tj2012

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by zhangj0754 at 2012-11-23 10:11:24
这两个酶我用过,可以直接连的,16度过夜就可以连上,没问题的

酶的最适温度不是37℃吗?
10楼2012-11-24 14:33:52
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