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小獠牙

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[求助] 用于连接的目的片段进行了去磷酸化怎么办已有3人参与

我将载体和目的片段分别双酶切之后，又分别都加了CIP去磷酸化一小时，但实际上应该只去磷酸化载体，现在我能否直接进行连接？或者有什么办法能恢复目的片段的5'端磷酸基团？

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1楼 2014-12-17 20:22:09

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yesucao

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还是建议你再重做一次酶切吧！！话说：你的载体和目的片段都是双酶切的，没必要去磷酸化吧，一般只有单酶切的时候载体才有必要去磷酸化。

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2楼2014-12-18 13:17:24

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Beryl_xu

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【答案】应助回帖

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重新做酶切。为何要去磷酸化，我之前没有这一步哟！

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3楼2014-12-18 13:53:24

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鬼羽帝魂

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4楼2014-12-18 14:54:56

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小獠牙: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-12-19 10:29:21

2楼的，注意一下啊，楼主用了同尾酶的话，就需要把载体去磷酸化防止自连。
建议楼主重新准备目的片段，切好了直接纯化后，做连接。
如果去做恢复目的片段的5'端磷酸基团，属于吃力不讨好的事情。

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5楼2014-12-18 17:22:40

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gangouyang

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【答案】应助回帖

引用回帖:

5楼: Originally posted by gangouyang at 2014-12-18 17:22:40
2楼的，注意一下啊，楼主用了同尾酶的话，就需要把载体去磷酸化防止自连。
建议楼主重新准备目的片段，切好了直接纯化后，做连接。
如果去做恢复目的片段的5'端磷酸基团，属于吃力不讨好的事情。

补充一下，两个平末端的酶，载体也是需要去磷酸化的，平末端会自连。

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6楼2014-12-18 22:42:19

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小獠牙

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引用回帖:

谢谢你哈，我会重新做酶切的。

主要是现在PCR突然又P不出来了，

明明还是用同样的体系

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7楼2014-12-19 10:30:31

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用 T4 PNK的酶就可以再加上磷酸基团

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8楼2014-12-19 20:43:09

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