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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR扩增效率很低
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godloveplum

金虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR扩增效率很低 已有11人参与

荧光定量PCR，什么参数都合格就是扩增效率很低，换了好多条件都很低，请问是怎么回事呀？引物我都加的1ul，cDNA加了1ul或者2ul，都试过，另外三步法也都试过，扩增效率都上不去，做了好多次都是，都快崩溃了。还有就是我的引物长度大概200多bp，有的接近300，一般都超过250了，这影响大吗？可是我都用三步法延伸了呀？求各位高手赐教呀！
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Nothingisimpossibleforawillingheart!
1楼 2014-12-15 16:20:11
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bbqlhb

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-15 18:09:37
排除法呗。
是不是cDNA问题，有没抑制物？
从哪里看出扩增效率上不去，以前做过吗？
用的sybr还是探针？
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2楼2014-12-15 16:29:26
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godloveplum

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bbqlhb at 2014-12-15 16:29:26
排除法呗。
是不是cDNA问题，有没抑制物？
从哪里看出扩增效率上不去，以前做过吗？
用的sybr还是探针？

用的是sybr，从一开始做，就做的标曲，一直都是扩增效率很低，不知道是不是cDNA的问题，怎样检查是不是cDNA的问题呀？
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Nothingisimpossibleforawillingheart!
3楼2014-12-15 16:49:27
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bbqlhb

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by godloveplum at 2014-12-15 16:49:27
用的是sybr，从一开始做，就做的标曲，一直都是扩增效率很低，不知道是不是cDNA的问题，怎样检查是不是cDNA的问题呀？...

测A260/A280，有没做溶解曲线，看看有没双峰出现，就是看有没非特异扩增
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4楼2014-12-15 17:01:28
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Beryl_xu

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-15 18:09:52
从提问来看，没办法一下判断哪儿的问题。需要自己一步步尝试。
总的来说，做qPCR实验，条件比较重要。扩增效率低，可能的原因是引物设计不当，或者反应条件不够优化。可以从这两点入手，引物设计问题，需要做溶解曲线，看看有无非特异性，如果扩增效率在90%以下，建议重新设计引物。还有你的模板是高浓度模板还是啥，存不存在抑制剂在里面。
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5楼2014-12-15 17:22:43
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cosign

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议换一对引物重新做
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6楼2014-12-15 20:43:19
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godloveplum

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bbqlhb at 2014-12-15 17:01:28
测A260/A280，有没做溶解曲线，看看有没双峰出现，就是看有没非特异扩增...

做了溶解曲线，溶解曲线没有双峰，其它参数也都合格，标曲上重复的点也都叠成了一个点，线性相关性也都不错，就是扩增效率上不去
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Nothingisimpossibleforawillingheart!
7楼2014-12-16 09:19:40
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godloveplum

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Beryl_xu at 2014-12-15 17:22:43
从提问来看，没办法一下判断哪儿的问题。需要自己一步步尝试。
总的来说，做qPCR实验，条件比较重要。扩增效率低，可能的原因是引物设计不当，或者反应条件不够优化。可以从这两点入手，引物设计问题，需要做溶解曲 ...

我的模板的第一个浓度大概在45ng/ul左右，然后5倍梯度稀释，2倍梯度稀释都做过，cDNA加的是2ul。
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Nothingisimpossibleforawillingheart!
8楼2014-12-16 09:22:05
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vege的桌子

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
荧光定量产物还是控制在100-150bp之间吧
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9楼2014-12-16 09:55:19
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xiao200x

新虫 (初入文坛)
扩增效率是由引物特性决定的，建议多换几对引物试试。祝实验顺利！
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10楼2014-12-17 09:27:46
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