应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR扩增效率很低
221/3返回列表123下一页
查看: 3006  |  回复: 21
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

godloveplum

金虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR扩增效率很低 已有11人参与

荧光定量PCR，什么参数都合格就是扩增效率很低，换了好多条件都很低，请问是怎么回事呀？引物我都加的1ul，cDNA加了1ul或者2ul，都试过，另外三步法也都试过，扩增效率都上不去，做了好多次都是，都快崩溃了。还有就是我的引物长度大概200多bp，有的接近300，一般都超过250了，这影响大吗？可是我都用三步法延伸了呀？求各位高手赐教呀！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
Nothingisimpossibleforawillingheart!
1楼 2014-12-15 16:20:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bbqlhb

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-15 18:09:37
排除法呗。
是不是cDNA问题，有没抑制物？
从哪里看出扩增效率上不去，以前做过吗？
用的sybr还是探针？
赞一下 回复此楼
2楼2014-12-15 16:29:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

godloveplum

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bbqlhb at 2014-12-15 16:29:26
排除法呗。
是不是cDNA问题，有没抑制物？
从哪里看出扩增效率上不去，以前做过吗？
用的sybr还是探针？

用的是sybr，从一开始做，就做的标曲，一直都是扩增效率很低，不知道是不是cDNA的问题，怎样检查是不是cDNA的问题呀？
赞一下 回复此楼
Nothingisimpossibleforawillingheart!
3楼2014-12-15 16:49:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bbqlhb

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by godloveplum at 2014-12-15 16:49:27
用的是sybr，从一开始做，就做的标曲，一直都是扩增效率很低，不知道是不是cDNA的问题，怎样检查是不是cDNA的问题呀？...

测A260/A280，有没做溶解曲线，看看有没双峰出现，就是看有没非特异扩增
赞一下 回复此楼
4楼2014-12-15 17:01:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Beryl_xu

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-15 18:09:52
从提问来看，没办法一下判断哪儿的问题。需要自己一步步尝试。
总的来说，做qPCR实验，条件比较重要。扩增效率低，可能的原因是引物设计不当，或者反应条件不够优化。可以从这两点入手，引物设计问题，需要做溶解曲线，看看有无非特异性，如果扩增效率在90%以下，建议重新设计引物。还有你的模板是高浓度模板还是啥，存不存在抑制剂在里面。
赞一下 回复此楼
5楼2014-12-15 17:22:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cosign

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议换一对引物重新做
赞一下 回复此楼
6楼2014-12-15 20:43:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

godloveplum

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bbqlhb at 2014-12-15 17:01:28
测A260/A280，有没做溶解曲线，看看有没双峰出现，就是看有没非特异扩增...

做了溶解曲线，溶解曲线没有双峰，其它参数也都合格，标曲上重复的点也都叠成了一个点，线性相关性也都不错，就是扩增效率上不去
赞一下 回复此楼
Nothingisimpossibleforawillingheart!
7楼2014-12-16 09:19:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

godloveplum

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Beryl_xu at 2014-12-15 17:22:43
从提问来看，没办法一下判断哪儿的问题。需要自己一步步尝试。
总的来说，做qPCR实验，条件比较重要。扩增效率低，可能的原因是引物设计不当，或者反应条件不够优化。可以从这两点入手，引物设计问题，需要做溶解曲 ...

我的模板的第一个浓度大概在45ng/ul左右，然后5倍梯度稀释，2倍梯度稀释都做过，cDNA加的是2ul。
赞一下 回复此楼
Nothingisimpossibleforawillingheart!
8楼2014-12-16 09:22:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

vege的桌子

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
荧光定量产物还是控制在100-150bp之间吧
赞一下 回复此楼
9楼2014-12-16 09:55:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiao200x

新虫 (初入文坛)
扩增效率是由引物特性决定的，建议多换几对引物试试。祝实验顺利！
赞一下 回复此楼
10楼2014-12-17 09:27:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 godloveplum 的主题更新
221/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 4/200 2026-08-08 04:07 by 6vVgjDL4CnGu
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 3/150 2026-08-08 03:47 by 6vVgjDL4CnGu
[基金申请] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 KXLV3nuBVBY7 2026-08-07 3/150 2026-08-08 03:27 by 6vVgjDL4CnGu
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变，有变的大神么？ +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
[基金申请] 关于代码变化问题，想知道的进来 +9 且听虎啸 2026-08-07 12/600 2026-08-07 21:53 by 理想三旬2025
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] 听说今天filecode变了 +24 布布和一二 2026-08-06 47/2350 2026-08-07 16:02 by zhiyanjiang
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +3 布布和一二 2026-08-07 3/150 2026-08-07 15:09 by gltch
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
[基金申请] 大家散了吧，后缀研究没有意义，别浪费时间了，过好目前的每一天，不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 7/350 2026-08-07 13:11 by 医学老男孩
[基金申请] 关于豆爷回答的JTJC与%2F数量 +4 yang182083 2026-08-06 6/300 2026-08-07 12:43 by 虫友是什么虫
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
[基金申请] 8月时间戳变的，举个手。玩一下，释放压力 +9 archvillain 2026-08-04 11/550 2026-08-05 20:06 by wlwhappy
[基金申请] 好消息？这个有何含义？？？ +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
[基金申请] 有没有H口的？有收到消息的吗？ +3 超级海虾 2026-08-04 3/150 2026-08-04 17:26 by 学教育滴
[基金申请] 纯娱乐，不喜欢勿喷 +7 Tide man 2026-08-04 10/500 2026-08-04 15:10 by loufangrui
[基金申请] 面上提前没消息，有中的吗 +14 archvillain 2026-08-02 18/900 2026-08-04 14:42 by archvillain
[基金申请] 什么时候能放榜呀？ +3 Jacob678 2026-08-03 3/150 2026-08-03 16:14 by gltch
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭