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2013201621

铁虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR绝对定量的标曲问题 已有1人参与

最近在做绝对定量,土壤样品细菌和真菌的丰度。关于标曲的问题,克隆测序正确,提完质粒(标准质粒,用于制作标曲)以后,到底要不要将质粒酶切线性化啊?我认为没有必要,可是看到一些论坛里有人说要酶切,以至于现在做的时候总感觉有点没搞清楚到底要不要酶切啊。有在做的虫友纠结这个问题吗?求指点~~~~
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FIGHTING
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猪猪会飞

木虫 (职业作家)


祝一帆风顺,心想事成。
2楼2014-12-14 11:55:57
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肥猫p

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我做过,没有线性化,我觉得没必要,我直接质粒做的,R2还可以。之前看有的paper说需要线性化,有的文章又说没影响,线性化后反而不稳定了。
楼主原核和真核都用的什么引物啊,有空能交流交流么?
3楼2014-12-14 20:05:59
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2013201621

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 肥猫p at 2014-12-14 20:05:59
我做过,没有线性化,我觉得没必要,我直接质粒做的,R2还可以。之前看有的paper说需要线性化,有的文章又说没影响,线性化后反而不稳定了。
楼主原核和真核都用的什么引物啊,有空能交流交流么?

细菌的是V3的341F/518R,真菌的是ITS引物5.8S/ITS1F   有人说如果不线性化的话质粒的超螺旋结构和线性化的基因组DNA的扩增效率不同。但是我们用标曲定量就是默认为质粒和基因组DNA扩增效率相同  不知95度变性能否破坏质粒的超螺旋结构?
FIGHTING
4楼2014-12-15 21:20:58
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2013201621

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 2013201621 at 2014-12-15 21:20:58
细菌的是V3的341F/518R,真菌的是ITS引物5.8S/ITS1F   有人说如果不线性化的话质粒的超螺旋结构和线性化的基因组DNA的扩增效率不同。但是我们用标曲定量就是默认为质粒和基因组DNA扩增效率相同  不知95度变性能否破 ...

还有啊  R平方说明你的线性拟合不错,但是扩增效率怎么样呢?
FIGHTING
5楼2014-12-15 21:22:29
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肥猫p

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

16S我一开始我也想扩V3区的,用的338F和518R,但是效果不好,后来改用V1区的,效果还好。R2=0.9921.扩增效率的算法是10(-1/斜率)-1.。。。。。。括弧里面为指数。
但是我ITS扩的线性很烂。
6楼2014-12-16 10:29:32
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研究室新生

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 肥猫p at 2014-12-14 20:05:59
我做过,没有线性化,我觉得没必要,我直接质粒做的,R2还可以。之前看有的paper说需要线性化,有的文章又说没影响,线性化后反而不稳定了。
楼主原核和真核都用的什么引物啊,有空能交流交流么?

你好~请问是否需要做线性化的文章楼楼那里还有吗?能不能发我看一下~最近也在做外源基因拷贝数绝对定量~用质粒做的标准品~质粒扩增效率不高~只有70%左右~不知道是不是因为没有做线性化的问题?~~另外线性化之后需要纯化处理吗?~~~急急~~谢谢楼主

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人生是一棵不停生长的树。
7楼2016-08-09 10:56:13
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