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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR绝对定量的标曲问题
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2013201621

铁虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR绝对定量的标曲问题 已有1人参与

最近在做绝对定量，土壤样品细菌和真菌的丰度。关于标曲的问题，克隆测序正确，提完质粒（标准质粒，用于制作标曲）以后，到底要不要将质粒酶切线性化啊？我认为没有必要，可是看到一些论坛里有人说要酶切，以至于现在做的时候总感觉有点没搞清楚到底要不要酶切啊。有在做的虫友纠结这个问题吗？求指点~~~~
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FIGHTING
1楼 2014-12-14 11:18:27
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猪猪会飞

木虫 (职业作家)
祝一帆风顺，心想事成。
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2楼2014-12-14 11:55:57
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肥猫p

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我做过，没有线性化，我觉得没必要，我直接质粒做的，R2还可以。之前看有的paper说需要线性化，有的文章又说没影响，线性化后反而不稳定了。
楼主原核和真核都用的什么引物啊，有空能交流交流么？
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3楼2014-12-14 20:05:59
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2013201621

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 肥猫p at 2014-12-14 20:05:59
我做过，没有线性化，我觉得没必要，我直接质粒做的，R2还可以。之前看有的paper说需要线性化，有的文章又说没影响，线性化后反而不稳定了。
楼主原核和真核都用的什么引物啊，有空能交流交流么？

细菌的是V3的341F/518R,真菌的是ITS引物5.8S/ITS1F   有人说如果不线性化的话质粒的超螺旋结构和线性化的基因组DNA的扩增效率不同。但是我们用标曲定量就是默认为质粒和基因组DNA扩增效率相同  不知95度变性能否破坏质粒的超螺旋结构？
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FIGHTING
4楼2014-12-15 21:20:58
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2013201621

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 2013201621 at 2014-12-15 21:20:58
细菌的是V3的341F/518R,真菌的是ITS引物5.8S/ITS1F   有人说如果不线性化的话质粒的超螺旋结构和线性化的基因组DNA的扩增效率不同。但是我们用标曲定量就是默认为质粒和基因组DNA扩增效率相同  不知95度变性能否破 ...

还有啊  R平方说明你的线性拟合不错，但是扩增效率怎么样呢？
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FIGHTING
5楼2014-12-15 21:22:29
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肥猫p

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

16S我一开始我也想扩V3区的，用的338F和518R，但是效果不好，后来改用V1区的，效果还好。R2=0.9921.扩增效率的算法是10（-1/斜率）-1.。。。。。。括弧里面为指数。
但是我ITS扩的线性很烂。
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6楼2014-12-16 10:29:32
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研究室新生

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 肥猫p at 2014-12-14 20:05:59
我做过，没有线性化，我觉得没必要，我直接质粒做的，R2还可以。之前看有的paper说需要线性化，有的文章又说没影响，线性化后反而不稳定了。
楼主原核和真核都用的什么引物啊，有空能交流交流么？

你好～请问是否需要做线性化的文章楼楼那里还有吗？能不能发我看一下～最近也在做外源基因拷贝数绝对定量～用质粒做的标准品～质粒扩增效率不高～只有70%左右～不知道是不是因为没有做线性化的问题？～～另外线性化之后需要纯化处理吗？～～～急急～～谢谢楼主

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人生是一棵不停生长的树。
7楼2016-08-09 10:56:13
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