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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 关于pet32a和目的条带双酶切
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fangjian268

木虫 (小有名气)

小小虫

[求助] 关于pet32a和目的条带双酶切 已有5人参与

目的片段1200左右，载体是pet32a
     双酶切体系   Ecor I        1ul
                        Hind III     1ul   
                        M buffer    4ul
            pet32a/目的片段    20ul
                          ddH2O    14ul
      酶切3小时后准备回收，做连接转化，但发现条带不太好，不好回收。电泳图在下面（p系列为pet32a     c系列为目的条带）
      想请教两个问题：
      1.pet32a被切开了没，可以回收做下一步吗？
      2.就是目的片段太暗，不好回收，怎样改进呢？   谢谢了

关于pet32a和目的条带双酶切
1111.jpg
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时间都去哪儿了
1楼 2014-11-19 14:32:36
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圆yy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fangjian268: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢! 2014-11-19 15:22:15
没有酶切完全，建议你用快切酶。40分钟可以完全切开，一般不会有三条带
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2楼2014-11-19 14:42:43
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fangjian268

木虫 (小有名气)

小小虫
引用回帖:
2楼: Originally posted by 圆yy at 2014-11-19 14:42:43
没有酶切完全，建议你用快切酶。40分钟可以完全切开，一般不会有三条带

不换酶呢，我同学和我一起做的，都很顺利，所以不好换酶的
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时间都去哪儿了
3楼2014-11-19 15:23:37
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fangjian268: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢解答 2014-11-19 16:24:57
1、载体酶切没有酶切完全，建议减少载体的加入量，适当增加酶用量；
2、你的目的片段是自己PCR扩增出来的，还是在T载体或者其他的载体上切下来的呢？如果是自己扩增出来的，可以直接用回收的PCR产物进行酶切。
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4楼2014-11-19 16:14:55
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fangjian268

木虫 (小有名气)

小小虫
引用回帖:
4楼: Originally posted by yesucao at 2014-11-19 16:14:55
1、载体酶切没有酶切完全，建议减少载体的加入量，适当增加酶用量；
2、你的目的片段是自己PCR扩增出来的，还是在T载体或者其他的载体上切下来的呢？如果是自己扩增出来的，可以直接用回收的PCR产物进行酶切。

目的片段是PCR产物回收后连接转化，培养菌液，提取的质粒。就是酶切条带所需要的条带很暗，请问怎么提高呢
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时间都去哪儿了
5楼2014-11-19 16:24:27
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zshw_001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-19 19:17:16
fangjian268: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢解答 2014-11-19 20:58:28
如果不是酶切没有切开，那就是你提取质粒不够浓度，菌液多养养，提取完跑个胶看看亮不亮。
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永远相信未知的总是美好的！
6楼2014-11-19 16:43:32
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-19 19:17:23
fangjian268: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2014-11-19 20:56:41
载体切得感觉挺好，你可以用没有切的载体做个对照
目的条带可以多弄一些回收连接，下下策是目的片段全部回收连接，挑斑鉴定
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7楼2014-11-19 16:50:38
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fangjian268

木虫 (小有名气)

小小虫
引用回帖:
6楼: Originally posted by zshw_001 at 2014-11-19 16:43:32
如果不是酶切没有切开，那就是你提取质粒不够浓度，菌液多养养，提取完跑个胶看看亮不亮。

我们实验室一般是10ml培养14小时，我用5ml回收一管80ul的质粒，应该不低了。请问你们那是怎么培养的呢，用多少ml回收质粒的呢！
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时间都去哪儿了
8楼2014-11-19 21:01:37
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fangjian268

木虫 (小有名气)

小小虫
引用回帖:
7楼: Originally posted by happydove at 2014-11-19 16:50:38
载体切得感觉挺好，你可以用没有切的载体做个对照
目的条带可以多弄一些回收连接，下下策是目的片段全部回收连接，挑斑鉴定

嗯，明天试试。目的条带有没有是加少了呢，哎。。。这实验有点恼火，看来我得多试试了
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时间都去哪儿了
9楼2014-11-19 21:04:53
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飞雪雄歆

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fangjian268(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-20 18:40:06
fangjian268: 金币+4, ★★★很有帮助, 谢谢解答 2014-11-20 21:27:25
延长酶切时间，酶切肯定是不完全！温度控制准确一下！空载质粒对照一下，很能说明问题了。

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10楼2014-11-20 11:35:16
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