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happydove

新虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by fangjian268 at 2014-11-19 21:04:53
嗯,明天试试。目的条带有没有是加少了呢,哎。。。这实验有点恼火,看来我得多试试了...

或者连接时目的条带多加一些  4度过夜连接
11楼2014-11-20 13:17:23
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
fangjian268: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢! 2014-11-20 21:24:03
引用回帖:
5楼: Originally posted by fangjian268 at 2014-11-19 16:24:27
目的片段是PCR产物回收后连接转化,培养菌液,提取的质粒。就是酶切条带所需要的条带很暗,请问怎么提高呢...

目的片段扩增的引物含有酶切位点和保护碱基吧,直接用引物扩增目的片段,回收,将回收的扩增产物进行双酶切,再回收,回收的东西就可以和载体是pet32a进行连接了。你可以试试。
12楼2014-11-20 16:28:22
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fangjian268

木虫 (小有名气)

小小虫

引用回帖:
12楼: Originally posted by yesucao at 2014-11-20 16:28:22
目的片段扩增的引物含有酶切位点和保护碱基吧,直接用引物扩增目的片段,回收,将回收的扩增产物进行双酶切,再回收,回收的东西就可以和载体是pet32a进行连接了。你可以试试。...

嗯,现在的就是按照这个步奏做的。。。
时间都去哪儿了
13楼2014-11-20 21:25:09
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fangjian268

木虫 (小有名气)

小小虫

引用回帖:
10楼: Originally posted by 飞雪雄歆 at 2014-11-20 11:35:16
延长酶切时间,酶切肯定是不完全!温度控制准确一下!空载质粒对照一下,很能说明问题了。

酶切时间是37℃,3小时,65℃,15分钟,应该没问题吧
时间都去哪儿了
14楼2014-11-20 21:27:02
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
载体切没切开,转化一下,或者做自连对照看看,另外你跑胶的时候酶切的载体和空载(未做任何处理的pet-32a)yi一起跑胶,看看,酶切后变成线性的会跑得慢,
关于目的片段,如果是PCR,那么一次多P几管,酶切的目的片段就多且一点,一定保证回收的量(用高质量的试剂盒回收如qiagen),才成保证连接及转化的成功,其实前期的准备才是关键
15楼2014-11-21 09:38:37
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