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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 关于pet32a和目的条带双酶切
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happydove

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by fangjian268 at 2014-11-19 21:04:53
嗯，明天试试。目的条带有没有是加少了呢，哎。。。这实验有点恼火，看来我得多试试了...

或者连接时目的条带多加一些  4度过夜连接
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11楼2014-11-20 13:17:23
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
fangjian268: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢! 2014-11-20 21:24:03
引用回帖:
5楼: Originally posted by fangjian268 at 2014-11-19 16:24:27
目的片段是PCR产物回收后连接转化，培养菌液，提取的质粒。就是酶切条带所需要的条带很暗，请问怎么提高呢...

目的片段扩增的引物含有酶切位点和保护碱基吧，直接用引物扩增目的片段，回收，将回收的扩增产物进行双酶切，再回收，回收的东西就可以和载体是pet32a进行连接了。你可以试试。
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12楼2014-11-20 16:28:22
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fangjian268

木虫 (小有名气)

小小虫
引用回帖:
12楼: Originally posted by yesucao at 2014-11-20 16:28:22
目的片段扩增的引物含有酶切位点和保护碱基吧，直接用引物扩增目的片段，回收，将回收的扩增产物进行双酶切，再回收，回收的东西就可以和载体是pet32a进行连接了。你可以试试。...

嗯，现在的就是按照这个步奏做的。。。
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时间都去哪儿了
13楼2014-11-20 21:25:09
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fangjian268

木虫 (小有名气)

小小虫
引用回帖:
10楼: Originally posted by 飞雪雄歆 at 2014-11-20 11:35:16
延长酶切时间，酶切肯定是不完全！温度控制准确一下！空载质粒对照一下，很能说明问题了。

酶切时间是37℃，3小时，65℃，15分钟，应该没问题吧
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时间都去哪儿了
14楼2014-11-20 21:27:02
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体切没切开，转化一下，或者做自连对照看看，另外你跑胶的时候酶切的载体和空载（未做任何处理的pet-32a）yi一起跑胶，看看，酶切后变成线性的会跑得慢，
关于目的片段，如果是PCR，那么一次多P几管，酶切的目的片段就多且一点，一定保证回收的量（用高质量的试剂盒回收如qiagen），才成保证连接及转化的成功，其实前期的准备才是关键
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15楼2014-11-21 09:38:37
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