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fangjian268

木虫 (小有名气)

小小虫

[求助] 关于pet32a和目的条带双酶切 已有5人参与

目的片段1200左右,载体是pet32a
     双酶切体系   Ecor I        1ul
                        Hind III     1ul   
                        M buffer    4ul
            pet32a/目的片段    20ul
                          ddH2O    14ul
      酶切3小时后准备回收,做连接转化,但发现条带不太好,不好回收。电泳图在下面(p系列为pet32a     c系列为目的条带)
      想请教两个问题:
      1.pet32a被切开了没,可以回收做下一步吗?
      2.就是目的片段太暗,不好回收,怎样改进呢?   谢谢了

关于pet32a和目的条带双酶切
1111.jpg
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
载体切没切开,转化一下,或者做自连对照看看,另外你跑胶的时候酶切的载体和空载(未做任何处理的pet-32a)yi一起跑胶,看看,酶切后变成线性的会跑得慢,
关于目的片段,如果是PCR,那么一次多P几管,酶切的目的片段就多且一点,一定保证回收的量(用高质量的试剂盒回收如qiagen),才成保证连接及转化的成功,其实前期的准备才是关键
15楼2014-11-21 09:38:37
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圆yy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
fangjian268: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢! 2014-11-19 15:22:15
没有酶切完全,建议你用快切酶。40分钟可以完全切开,一般不会有三条带
2楼2014-11-19 14:42:43
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fangjian268

木虫 (小有名气)

小小虫

引用回帖:
2楼: Originally posted by 圆yy at 2014-11-19 14:42:43
没有酶切完全,建议你用快切酶。40分钟可以完全切开,一般不会有三条带

不换酶呢,我同学和我一起做的,都很顺利,所以不好换酶的
时间都去哪儿了
3楼2014-11-19 15:23:37
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
fangjian268: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢解答 2014-11-19 16:24:57
1、载体酶切没有酶切完全,建议减少载体的加入量,适当增加酶用量;
2、你的目的片段是自己PCR扩增出来的,还是在T载体或者其他的载体上切下来的呢?如果是自己扩增出来的,可以直接用回收的PCR产物进行酶切。
4楼2014-11-19 16:14:55
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