应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建真核表达载体问题
71/1返回列表
查看: 2016  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

菁菁很蛋疼

新虫 (初入文坛)

[交流] 构建真核表达载体问题

小生最近在尝试将3100bp的片段与真核质粒PC3.1连接，选择BamH1和Xho1双酶切，37℃ 6小时，T4连接酶16℃过夜，尝试6次都连不上，质粒PCR我设计了一段引物可以扩3000中的300bp，几乎每次都扩的出来，但是送测一般都是空载或者插入小于100bp。快疯了，PCR我用的pfu酶，我现在想彻底换了酶，酶切位点，载体，求大神给点意见和建议
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-11-18 14:58:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

维真生物

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
换个载体试试，我们有penter载体

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2014-11-18 16:47:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

caihang

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
菁菁很蛋疼(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:02:08
送测后是空载体或小于100bp你有没有想过是什么问题？
其实这说明了
1，你的酶切不彻底
2，你在加入目标片段时，片段不纯，有杂带，胶回收试试。
3，3100的片段连上载体肯定很困难，建议每次多设几组比例进行连接。
4，xho1这个酶切位点，你去查一下，问题可能就是它。
5，片段太大可以试试别的连接方式，不一定非要用粘性末端连。
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2014-11-18 22:44:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

吟啸徐行

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
菁菁很蛋疼(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:02:27
你的3100bp的片段是怎么得到的？从克隆载体上直接酶切下来的吗？
会不会是pfu酶的问题，我记得pfu扩增出来的平末端的片段，你要是用pfu扩增你的3100片段，变成平末端去和克隆载体连接的确不好连。
赞一下 回复此楼
4楼2014-11-20 23:21:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

smdsfy

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
菁菁很蛋疼(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:02:35
酶切载体与酶切片段的准备是否够量，酶切后切胶回收检测浓度，再根据摩尔比1:10，酶切片段过量，但酶切载体的量也要充足，且要做好自连对照，如果在你保证酶切载体与酶切片段足够的情况下，还是不成功，那么换其他人做试试，或者换其他的方法
赞一下 回复此楼
5楼2014-11-21 09:31:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cdde1234

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
pcr能出现，可能是试剂被污染了
赞一下 回复此楼
6楼2014-11-21 10:00:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

DOVElalala

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用的KOD fx高保真酶。
赞一下 回复此楼
7楼2015-01-14 16:34:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 菁菁很蛋疼 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭