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菁菁很蛋疼

新虫 (初入文坛)

[交流] 构建真核表达载体问题

小生最近在尝试将3100bp的片段与真核质粒PC3.1连接，选择BamH1和Xho1双酶切，37℃ 6小时，T4连接酶16℃过夜，尝试6次都连不上，质粒PCR我设计了一段引物可以扩3000中的300bp，几乎每次都扩的出来，但是送测一般都是空载或者插入小于100bp。快疯了，PCR我用的pfu酶，我现在想彻底换了酶，酶切位点，载体，求大神给点意见和建议
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1楼 2014-11-18 14:58:06
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维真生物

新虫 (初入文坛)
★
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换个载体试试，我们有penter载体

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2楼2014-11-18 16:47:43
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caihang

铜虫 (小有名气)
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菁菁很蛋疼(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:02:08
送测后是空载体或小于100bp你有没有想过是什么问题？
其实这说明了
1，你的酶切不彻底
2，你在加入目标片段时，片段不纯，有杂带，胶回收试试。
3，3100的片段连上载体肯定很困难，建议每次多设几组比例进行连接。
4，xho1这个酶切位点，你去查一下，问题可能就是它。
5，片段太大可以试试别的连接方式，不一定非要用粘性末端连。
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3楼2014-11-18 22:44:19
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吟啸徐行

银虫 (小有名气)
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菁菁很蛋疼(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:02:27
你的3100bp的片段是怎么得到的？从克隆载体上直接酶切下来的吗？
会不会是pfu酶的问题，我记得pfu扩增出来的平末端的片段，你要是用pfu扩增你的3100片段，变成平末端去和克隆载体连接的确不好连。
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4楼2014-11-20 23:21:54
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smdsfy

铜虫 (小有名气)
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菁菁很蛋疼(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:02:35
酶切载体与酶切片段的准备是否够量，酶切后切胶回收检测浓度，再根据摩尔比1:10，酶切片段过量，但酶切载体的量也要充足，且要做好自连对照，如果在你保证酶切载体与酶切片段足够的情况下，还是不成功，那么换其他人做试试，或者换其他的方法
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5楼2014-11-21 09:31:28
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cdde1234

金虫 (正式写手)
★
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pcr能出现，可能是试剂被污染了
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6楼2014-11-21 10:00:24
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DOVElalala

铜虫 (初入文坛)
★
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用的KOD fx高保真酶。
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7楼2015-01-14 16:34:52
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