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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求设计荧光定量PCR引物一对（SYBGREEN)
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generalel

金虫 (小有名气)

[求助] 求设计荧光定量PCR引物一对（SYBGREEN) 已有1人参与

各位大神，最近需做荧光定量，求设计引物一对，我会选取几对引物进行试验，然后把结果反馈给大家。
上引物模板：ATGTATCACC CGCAGTGCGA GCTCCTGACG ATGGCGCACG AAACGCCGGA CCTGGACGCC
61       GGCCAGCCGC ACCTAACCGT CTCCGGCGTC GCCAGCATCC CGGCAGAGCT GAGCTTCCAC
121      CTGCTGCACT CGCTCGACGC CGCGGCGGCG GTCAATCCCG TCACGGCGCC GCCGCAGTCC
181      ACCATCGACT ACTTCCTCGG CGGCGCCGAT CCCCACCAGC AGGCCATGCA GTACGAGCCG
241      CTGCCGCCCG CCGCGGGCGG CCACCACCAG TACACCATGG ACATGTTCCG CGACTACTGC
301      GACGGCAACT ACCCCACCGC CGAGCCGTAC ATCCGCGGGA CAATGACTGG AGCCCTCGTG
361      TTCGGGGCCA CCGACGACGA CGACTCGGCC GCTGCCGCCT ACATGCCCGG GGGGCACTTT
421      GAGACCTCCC CGCCGCCGCC ACGCGCCACC GGCCGCGGCA GGAAGCGGGG CAGGGCGCTG
481      GGCGGCGGCT TCCATGCTGT GCTGGCCAAC GGCGTCGAGA AGAAGGAGAA GCAGCGCCGG
541      CTGCGGCTCA CCGAGAAGTT TACGGCCCTC ATGCACCTCA TACCCAACGT TACGAAG
下引物模板：
ACT
601      GATAGGGCGA CGGTGATCTC GGACGCGATC GAGTACATCC AGGAGCTGGG GAGGACGGTG
661      GAGGAGCTGA CGCTGCTGGT GGAGAAGAAG CGGCGCCGGA GGGAGCTGCA GGGGGACGTC
721      GTGGACGCGG CGCCGGCTGC GGTGGTTGCT GCCGCCGGTG AGGCGGAGAG CTCGGAGGGC
781      GAGGTGGCTC CTCCGCCGCT GGCCGTGCCG CGGCAGCCGA TCCGGAGCAC GTACATCCAG
841      CGGCGGAGCA AGGACACGTC CGTGGACGTG CGGATCGTGG AGGAGGACGT GAACATCAAG
901      CTCACCAAGC GCCGGCGCGA CGGGTGCCTC GCAGCCGCGT CGCGCGCGCT GGACGACCTC
961      CGCCTTGACC TCGTCCACCT CTCCGGCGGC AAGATCGGTG ACTGTCAAAT CTACATGTTC
1021     AACACCAAGA TTCACAAGGG GTCTTCAGTG TTTGCGAGTG CAGTGGCCGG TAGGCTGATG
1081     GAAGTGGTGG ACGAGTACTA G
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1楼 2014-11-11 23:31:10
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意萧02

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-11-12 11:21:55
generalel: 金币+20, ★★★★★最佳答案 2014-11-13 10:28:29
做荧光定量没必要限定位置吧？看表达就行，给楼主设了几对引物：
（1）F:TTCAACACCAAGATTCACAAG (TM=60.8)  R:GTCCACCACTTCCATCAG(TM=61.2)
(2) F:ATGTTCAACACCAAGATTCAC(TM=60.9)    R:GTCCACCACTTCCATCAG(TM=61.2)
(3) F:GTCCACCACTTCCATCAG(YM=62.2)    R:ACCACTTCCATCAGCCTAC(TM=63)
你先试试，不同的引物表达量可能有一点点差异，但是总体是不影响与对照之间的表达差异的。
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2楼2014-11-12 08:53:10
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generalel

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 意萧02 at 2014-11-12 08:53:10
做荧光定量没必要限定位置吧？看表达就行，给楼主设了几对引物：
（1）F:TTCAACACCAAGATTCACAAG (TM=60.8)  R:GTCCACCACTTCCATCAG(TM=61.2)
(2) F:ATGTTCAACACCAAGATTCAC(TM=60.9)    R:GTCCACCACTTCCATCAG(TM=61 ...

我这个由于试验需要，所以要求上下引物有固定的模板序列啦。
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3楼2014-11-12 11:00:35
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意萧02

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by generalel at 2014-11-12 11:00:35
我这个由于试验需要，所以要求上下引物有固定的模板序列啦。...

那你试试这个引物：F:CCTCATGCACCTCATACC(TM=61)
R:CAGCTCCTGGATGTACTC(TM=60.3)
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4楼2014-11-12 17:11:25
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generalel

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 意萧02 at 2014-11-12 17:11:25
那你试试这个引物：F:CCTCATGCACCTCATACC(TM=61)
R:CAGCTCCTGGATGTACTC(TM=60.3)...

谢谢啦，看来你的确是高手。你设计的引物和文献报道的基本一样哦。请问你用什么软件设计的啊，我想学习学习？
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5楼2014-11-13 10:27:14
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意萧02

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-11-14 23:13:34
引用回帖:
5楼: Originally posted by generalel at 2014-11-13 10:27:14
谢谢啦，看来你的确是高手。你设计的引物和文献报道的基本一样哦。请问你用什么软件设计的啊，我想学习学习？...

pp5设的，我一般是这样的抓住两个点：
（1）找保守区的特异性片段
（2）片段大小不要太大100左右
其他按正常的引物设计去设，其实这个引物设计有点像做干扰载体的引物设计，当然也是有区别的（干扰载体两端加酶切位点），多设几个就有经验啦，多找找资料，设计这个的软件也挺多的，新手推荐你用用
Beacon Designer。
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6楼2014-11-13 11:20:52
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generalel

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 意萧02 at 2014-11-13 11:20:52
pp5设的，我一般是这样的抓住两个点：
（1）找保守区的特异性片段
（2）片段大小不要太大100左右
其他按正常的引物设计去设，其实这个引物设计有点像做干扰载体的引物设计，当然也是有区别的（干扰载体两端加酶 ...

好的，谢谢了.我不会找保守区啊？也不会找特异片段？是用ncbi blast吗？
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7楼2014-11-13 22:05:08
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意萧02

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by generalel at 2014-11-13 22:05:08
好的，谢谢了.我不会找保守区啊？也不会找特异片段？是用ncbi blast吗？...

是

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-11-13 22:50:53
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