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小雒饕餮

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒载体构建不成功 已有7人参与

质粒重组转入DH5α,多次不长斑 ,偶尔有斑后,PCR有带 ,酶切无带,怎么回事?求各位高手解答下,菜鸟我做了半年了好惆怅、、、、
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-10-31 22:26:20
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-10-31 23:10:31
酶切无带说明根本没连上吧,pcr很可能只是假阳性

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-10-31 19:37:30
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dongdekun

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-04 22:42:23
8成是质粒重组的问题。
从重组质粒开始,仔细检查每一步试验,限制性内切酶?平末端/粘性末端?质粒/目的基因摩尔比?抗生素种类/用量?
PCR假阳性很普遍,作为初筛可以,最终结果以酶切和测序为准。
3楼2014-11-02 13:21:26
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小雒饕餮(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:07:42
酶切没带的话估计是没连上,你再试着连一下吧
···
4楼2014-11-02 14:34:47
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小雒饕餮

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yuguiyan at 2014-10-31 19:37:30
酶切无带说明根本没连上吧,pcr很可能只是假阳性

我认为也是连接出了问题,但是就是找不到解决办法
5楼2014-11-03 20:08:31
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你具体是怎么做的?
6楼2014-11-04 14:49:46
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小雒饕餮

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by smdsfy at 2014-11-04 14:49:46
你具体是怎么做的?

目的基因比例1:5或1:7 , 16度水浴过夜链接,转如大肠杆菌,长斑后PCR, 酶切
7楼2014-11-20 09:52:38
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖


小雒饕餮(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-20 17:08:47
应该重组不成功,菌落的质粒为目的片段原本的载体,可能在切胶回收的时候带入。所以菌落少,PCR阳性,质粒酶切不对。
8楼2014-11-20 10:59:59
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smdsfy

铜虫 (小有名气)


小雒饕餮(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-20 17:09:00
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小雒饕餮 at 2014-11-20 09:52:38
目的基因比例1:5或1:7 , 16度水浴过夜链接,转如大肠杆菌,长斑后PCR, 酶切...

连接前的胶回收的载体与目的基因浓度多大?做连接前一定要保证载体的量(至少20~50ng),目的基因过量;而且做好对照,载体+水(代替目的基因)+T4 ligase+buffer,同样条件连接然后转化,另外载体直接转化,如果载体两端产生粘性末端则载体无法自连,载体处理好了才能与有相同末端的目的基因相连,不是长出斑都OK,活着PCR能P出来就OK的,一定做好阴性对照,就是我刚才说的载体自连的对照
9楼2014-11-20 13:51:39
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by smdsfy at 2014-11-20 13:51:39
连接前的胶回收的载体与目的基因浓度多大?做连接前一定要保证载体的量(至少20~50ng),目的基因过量;而且做好对照,载体+水(代替目的基因)+T4 ligase+buffer,同样条件连接然后转化,另外载体直接转化,如果载体 ...

不好意思,是“或者”而不是“活着”
10楼2014-11-21 09:21:13
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