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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒载体构建不成功
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小雒饕餮

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒载体构建不成功 已有7人参与

质粒重组转入DH5α，多次不长斑 ，偶尔有斑后，PCR有带 ，酶切无带，怎么回事？求各位高手解答下，菜鸟我做了半年了好惆怅、、、、
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1楼 2014-10-31 19:28:03
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-31 22:26:20
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-10-31 23:10:31
酶切无带说明根本没连上吧，pcr很可能只是假阳性

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2楼2014-10-31 19:37:30
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dongdekun

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-04 22:42:23
8成是质粒重组的问题。
从重组质粒开始，仔细检查每一步试验，限制性内切酶？平末端/粘性末端？质粒/目的基因摩尔比？抗生素种类/用量？
PCR假阳性很普遍，作为初筛可以，最终结果以酶切和测序为准。
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3楼2014-11-02 13:21:26
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小雒饕餮(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:07:42
酶切没带的话估计是没连上，你再试着连一下吧
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···
4楼2014-11-02 14:34:47
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小雒饕餮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuguiyan at 2014-10-31 19:37:30
酶切无带说明根本没连上吧，pcr很可能只是假阳性

我认为也是连接出了问题，但是就是找不到解决办法
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5楼2014-11-03 20:08:31
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你具体是怎么做的？
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6楼2014-11-04 14:49:46
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小雒饕餮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by smdsfy at 2014-11-04 14:49:46
你具体是怎么做的？

目的基因比例1：5或1:7 ， 16度水浴过夜链接，转如大肠杆菌，长斑后PCR, 酶切
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7楼2014-11-20 09:52:38
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
小雒饕餮(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-20 17:08:47
应该重组不成功，菌落的质粒为目的片段原本的载体，可能在切胶回收的时候带入。所以菌落少，PCR阳性，质粒酶切不对。
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8楼2014-11-20 10:59:59
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smdsfy

铜虫 (小有名气)
★
小雒饕餮(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-20 17:09:00
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小雒饕餮 at 2014-11-20 09:52:38
目的基因比例1：5或1:7 ， 16度水浴过夜链接，转如大肠杆菌，长斑后PCR, 酶切...

连接前的胶回收的载体与目的基因浓度多大？做连接前一定要保证载体的量（至少20~50ng），目的基因过量；而且做好对照，载体+水(代替目的基因)+T4 ligase+buffer，同样条件连接然后转化，另外载体直接转化，如果载体两端产生粘性末端则载体无法自连，载体处理好了才能与有相同末端的目的基因相连，不是长出斑都OK，活着PCR能P出来就OK的，一定做好阴性对照，就是我刚才说的载体自连的对照
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9楼2014-11-20 13:51:39
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smdsfy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by smdsfy at 2014-11-20 13:51:39
连接前的胶回收的载体与目的基因浓度多大？做连接前一定要保证载体的量（至少20~50ng），目的基因过量；而且做好对照，载体+水(代替目的基因)+T4 ligase+buffer，同样条件连接然后转化，另外载体直接转化，如果载体 ...

不好意思，是“或者”而不是“活着”
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10楼2014-11-21 09:21:13
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