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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒载体构建不成功
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小雒饕餮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by smdsfy at 2014-11-21 09:21:13
不好意思，是“或者”而不是“活着”...

好吧好苦脑
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11楼2014-11-24 12:39:51
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小雒饕餮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by smdsfy at 2014-11-21 09:21:13
不好意思，是“或者”而不是“活着”...

谢谢啦
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12楼2014-11-24 12:42:22
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小雒饕餮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-11-20 10:59:59
应该重组不成功，菌落的质粒为目的片段原本的载体，可能在切胶回收的时候带入。所以菌落少，PCR阳性，质粒酶切不对。

p c r是假阳性的.酶切切不出来
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13楼2014-11-24 12:50:23
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小雒饕餮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小冀- at 2014-11-02 14:34:47
酶切没带的话估计是没连上，你再试着连一下吧

好吧
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14楼2014-11-24 12:53:48
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小雒饕餮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by dongdekun at 2014-11-02 13:21:26
8成是质粒重组的问题。
从重组质粒开始，仔细检查每一步试验，限制性内切酶？平末端/粘性末端？质粒/目的基因摩尔比？抗生素种类/用量？
PCR假阳性很普遍，作为初筛可以，最终结果以酶切和测序为准。

嗯。谢
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15楼2014-11-24 12:54:51
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cckk_2000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小雒饕餮(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:08:04
我觉得改一下条件比较好，16度水浴很难实现，室温差不多在21度，过夜的话水温也在20度左右，还不如选择21度连接一个小时，或者16度用PCR仪来替代。另外连接的时候载体和目的片段最好能根据片段大小确定实际比例，具体可以参考NEB公司有一个在线计算系统，根据公式来做。
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科研炮灰
16楼2014-11-24 15:11:49
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Carpedime

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你的buffer是不是多次冻融过的？

[ 发自小木虫客户端 ]
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17楼2014-11-24 15:27:54
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