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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体构建后诱导不表达
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)

[求助] 载体构建后诱导不表达 已有2人参与

各位虫友，我有个问题一直困扰我：我在将目的基因插入表达载体中时，我的目的基因扩增引物是这样的：上游引物GGGGTACC -gcATGTCTAACCAAATATACTCAGCG
下游引物：ACATGCATGC -TCCGATAATGTTCCAAAGGAAGC
这个构建的载体是做基因敲除后回补用的，我想问的是上游引物中在酶切位点和起始密码子之间多了两个碱基gc对表达有影响吗？我用的载体是Pyes2，启动子是半乳糖诱导表达的gal1！但是诱导后SDS-PAGE后含有表达载体的酵母和含有空载体的酵母对照后条带都一样！这样是否能说明我的表达载体没有表达呢？做了快一个月了还没做出来，快毕业了！求指教啊
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1楼 2014-10-13 10:47:47
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圆yy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-13 15:56:48
有影响，会读码紊乱的，要加就加3的倍数的碱基，要不然起始密码子就读不出来啦。你加的是酶的保护碱基，只要在酶碱基的5端加就可以啦，不要在3端乱加东西
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2楼2014-10-13 11:25:08
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 圆yy at 2014-10-13 11:25:08
有影响，会读码紊乱的，要加就加3的倍数的碱基，要不然起始密码子就读不出来啦。你加的是酶的保护碱基，只要在酶碱基的5端加就可以啦，不要在3端乱加东西

我已近问了实验室的一个人了，他说没影响啊，他说启动子和起始密码子之间的距离没有定数！真正读码是从起始密码子ATG开始的？但为什么我的就是不表达呢？
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3楼2014-10-13 14:22:12
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jian212

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
下游引物 ：GCTTCCTTTGGAACATTATCGGAGCATGCATGT

终止密码子不对。。
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学习再学习，努力再努力。
4楼2014-10-13 16:04:50
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
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···
5楼2014-10-20 10:29:52
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jian212 at 2014-10-13 16:04:50
下游引物 ：GCTTCCTTTGGAACATTATCGGAGCATGCATGT

终止密码子不对。。

哦哦，其实我弄错了，我下游引物那里不是指的TAA，我的下游引物是在终止密码子300bp以后设计的！
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6楼2015-02-04 11:07:29
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