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小雒饕餮

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 42
帖子: 17
在线: 13.1小时
虫号: 3497160
注册: 2014-10-25
性别: MM
专业: 林木遗传育种学

[求助] 质粒载体构建不成功已有7人参与

质粒重组转入DH5α，多次不长斑，偶尔有斑后，PCR有带，酶切无带，怎么回事？求各位高手解答下，菜鸟我做了半年了好惆怅、、、、

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1楼2014-10-31 19:28:03

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

smdsfy

铜虫 (小有名气)

应助: 11 (小学生)
金币: 790.7
红花: 2
帖子: 73
在线: 79.2小时
虫号: 1285261
注册: 2011-05-04
性别: GG
专业: 生物大分子结构与功能

★
小雒饕餮(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-20 17:09:00

引用回帖:

7楼: Originally posted by 小雒饕餮 at 2014-11-20 09:52:38
目的基因比例1：5或1:7 ， 16度水浴过夜链接，转如大肠杆菌，长斑后PCR, 酶切...

连接前的胶回收的载体与目的基因浓度多大？做连接前一定要保证载体的量（至少20~50ng），目的基因过量；而且做好对照，载体+水(代替目的基因)+T4 ligase+buffer，同样条件连接然后转化，另外载体直接转化，如果载体两端产生粘性末端则载体无法自连，载体处理好了才能与有相同末端的目的基因相连，不是长出斑都OK，活着PCR能P出来就OK的，一定做好阴性对照，就是我刚才说的载体自连的对照