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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒构建问题
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zrj123456

新虫 (小有名气)

[交流] 质粒构建问题 已有8人参与

单酶切质粒后，出现两个片段，不做胶回收，清洁后直接与另一个酶切后载体连接，会出现什么现象？胶回收率实在是低啊？想这样竞争结合，会出现我要的结果吗
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1楼 2014-10-23 17:05:55
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zergbloody

铁虫 (正式写手)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-24 20:41:00
效率低不怕 其实很少量的载体也可以连接的 多了反而会抑制连接反应 关键是你连接酶要够好

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2楼2014-10-23 22:50:20
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jiaowenqiang

铜虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
为什么会单酶切？那样的话怎么连接载体？
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3楼2014-10-24 08:16:06
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jiaowenqiang

铜虫 (正式写手)
为什么单酶切，怎么连接载体呢
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4楼2014-10-24 08:16:38
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zrj123456

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jiaowenqiang at 2014-10-24 08:16:38
为什么单酶切，怎么连接载体呢

目标片段的载体上有两个PAC1的酶切位点，正好切出两个片段
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5楼2014-10-24 09:48:51
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zrj123456

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zergbloody at 2014-10-23 22:50:20
效率低不怕 其实很少量的载体也可以连接的 多了反而会抑制连接反应 关键是你连接酶要够好

不是的，胶回收的是片段，片段太少，载体直接清洁就好了，但是好像回收后酶连效率很低，我们实验室很少有成功的，所以想不做胶回收，直接清洁，酶连，这样切下来的那个载体也在，会对实验结果产生什么影响啊？
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6楼2014-10-24 09:54:19
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zrj123456

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zergbloody at 2014-10-23 22:50:20
效率低不怕 其实很少量的载体也可以连接的 多了反而会抑制连接反应 关键是你连接酶要够好

是TAKARA的T4，可以吗
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7楼2014-10-24 09:57:51
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zergbloody

铁虫 (正式写手)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-24 20:41:12
引用回帖:
7楼: Originally posted by zrj123456 at 2014-10-24 09:57:51
是TAKARA的T4，可以吗...

片段多了也会抑制 建议你4还是都回收 使用ta克隆试剂盒里的solutionI体系来连接 载体加0.2 片段也做几个稀释浓度 我做过 效率还可以

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8楼2014-10-24 13:13:01
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-24 20:41:23
最好选择两个单酶切点进行双酶切，否则很容易就自连的，连接的时候也会出现好多问题，如果连不上的话都不知道是哪里出了问题
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···
9楼2014-10-24 13:55:05
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刘芬玲

金虫 (初入文坛)
★
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单酶切后连接，那样的话片段不会反方向连接吗？求学习。。。
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10楼2014-10-25 11:10:29
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