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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒构建问题
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zrj123456

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zergbloody at 2014-10-24 13:13:01
片段多了也会抑制 建议你4还是都回收 使用ta克隆试剂盒里的solutionI体系来连接 载体加0.2 片段也做几个稀释浓度 我做过 效率还可以
...

0.2是指什么？体积还是pmol
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11楼2014-10-26 15:37:19
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-26 20:47:49
这样很不好做。
1.你一个用单酶切，切下的两端酶切位点一样，这样的片段不太好连上。
2.载体也是相同的酶，会自连。
本来都回收纯化后的就自连很多，再这样就更不好做了。
而且载体需要去磷酸化。
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12楼2014-10-26 15:45:15
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-26 20:47:57
理论上是可以这样做的，两个载体酶切后混合连接，能产生若干载体组合，其中含有目标载体。但有时由于片段大小或序列组成差异，效率比较低，而且你的是单酶切连接，自连的比率更大！需要考虑多种非目标重组子的筛选策略！能不用尽量不用这种方法，工作量大！

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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
13楼2014-10-26 16:09:31
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zergbloody

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zrj123456 at 2014-10-26 15:37:19
0.2是指什么？体积还是pmol...

体积

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14楼2014-10-26 19:13:11
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zrj123456

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-10-26 15:45:15
这样很不好做。
1.你一个用单酶切，切下的两端酶切位点一样，这样的片段不太好连上。
2.载体也是相同的酶，会自连。
本来都回收纯化后的就自连很多，再这样就更不好做了。
而且载体需要去磷酸化。

为什么不太好连上？不是有粘性末端吗？现在我已经做了三批了，每次连假阳性的都没有长出来，转化后的板子特别干净！！！所以才想着这样做，会不会是浓度太低的原因了，我的载体每次都去磷酸化
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15楼2014-10-27 08:30:38
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zrj123456

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by yudaoqian88 at 2014-10-26 16:09:31
理论上是可以这样做的，两个载体酶切后混合连接，能产生若干载体组合，其中含有目标载体。但有时由于片段大小或序列组成差异，效率比较低，而且你的是单酶切连接，自连的比率更大！需要考虑多种非目标重组子的筛选策 ...

我是这样想的，去取多重自连，用载体上的抗性筛选，应该只有三种：载体自连、载体与目标片段链接，载体与不要的载体链接，用菌落PCR应该可以筛选出来吧？我这样考虑的对不对啊？谢谢大侠
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16楼2014-10-27 08:34:32
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zrj123456

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by zergbloody at 2014-10-26 19:13:11
体积
...

谢谢，我按您说的做了一个，结果出来来汇报！
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17楼2014-10-27 08:36:11
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393658000

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-30 19:15:11
没记错PacI酶切以后的3‘突出末端，连接本来就会比5’突出端难；另外您这是载体，片段都是单酶切，结果会出现很多种情况，比如，载体自连；片段叠加后再跟载体连；同时您的片段也是从一个质粒上单酶切下来的，也有再连回去的可能；不知道为何你说回收效率很低，是切片段的质粒大小跟片段大小差异太大还是说什么情况完全不清楚，所以没法给你更多的建议；您不妨把情况说的更清楚些！
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18楼2014-10-27 10:11:14
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-30 19:15:20
引用回帖:
16楼: Originally posted by zrj123456 at 2014-10-27 08:34:32
我是这样想的，去取多重自连，用载体上的抗性筛选，应该只有三种：载体自连、载体与目标片段链接，载体与不要的载体链接，用菌落PCR应该可以筛选出来吧？我这样考虑的对不对啊？谢谢大侠...

假如前一个载体酶切后产生a,b两个片段，后一个载体酶切后产生c片段，那么理论上会产生a自连产物，b自连产物，a,b重组自连产物，c自连产物，c与a,b之一自连产物，可借助质粒完整性与否，抗性，特异基因，重组子大小等加以筛选！我就是这么做的，只是别的方法连不上以后才这样做！

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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
19楼2014-10-27 10:25:34
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小T在努力！

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
清洁是什么。。。求科普。用试剂盒回收重复最后一步还是没问题的。可以测一下回收产物的od，再确定连接反应体系中片段的量啊！

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加油哦！
20楼2014-10-27 10:44:33
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