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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒构建问题
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zrj123456

新虫 (小有名气)

[交流] 质粒构建问题 已有8人参与

单酶切质粒后，出现两个片段，不做胶回收，清洁后直接与另一个酶切后载体连接，会出现什么现象？胶回收率实在是低啊？想这样竞争结合，会出现我要的结果吗
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1楼 2014-10-23 17:05:55
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金虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-30 19:15:11
没记错PacI酶切以后的3‘突出末端，连接本来就会比5’突出端难；另外您这是载体，片段都是单酶切，结果会出现很多种情况，比如，载体自连；片段叠加后再跟载体连；同时您的片段也是从一个质粒上单酶切下来的，也有再连回去的可能；不知道为何你说回收效率很低，是切片段的质粒大小跟片段大小差异太大还是说什么情况完全不清楚，所以没法给你更多的建议；您不妨把情况说的更清楚些！
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18楼2014-10-27 10:11:14
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金虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-30 19:15:58
引用回帖:
21楼: Originally posted by zrj123456 at 2014-10-27 10:58:26
谢谢您，我不太明白您说的3末端比5末端难连是什么情况？我做了几次胶回收用20微升去离子水回收，浓度都只是30ng/μl左右，目的片段是8kb，载体5kb，连了几次，都是连假阳性都没有，不知道什么情况，感受态实验室都 ...

你找一本NEB的书就可以知道了，3‘末端突出比5’末端突出会难连很多；至于你说的目的片段8KB，载体5KB，你不妨反过来用，8KB的当做载体，5KB 当做片段，然后去算下比例，按比例连接吧，4度过夜连；最后感受态的问题，你这质粒加起来13K了，不知道你是何种感受态，找个效率高点的转化吧。
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30楼2014-10-28 10:58:02
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