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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒构建问题
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zrj123456

新虫 (小有名气)
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18楼: Originally posted by 393658000 at 2014-10-27 10:11:14
没记错PacI酶切以后的3‘突出末端，连接本来就会比5’突出端难；另外您这是载体，片段都是单酶切，结果会出现很多种情况，比如，载体自连；片段叠加后再跟载体连；同时您的片段也是从一个质粒上单酶切下来的，也有再 ...

谢谢您，我不太明白您说的3末端比5末端难连是什么情况？我做了几次胶回收用20微升去离子水回收，浓度都只是30ng/μl左右，目的片段是8kb，载体5kb，连了几次，都是连假阳性都没有，不知道什么情况，感受态实验室都用，酶也是公用，
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21楼2014-10-27 10:58:26
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zrj123456

新虫 (小有名气)
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19楼: Originally posted by yudaoqian88 at 2014-10-27 10:25:34
假如前一个载体酶切后产生a,b两个片段，后一个载体酶切后产生c片段，那么理论上会产生a自连产物，b自连产物，a,b重组自连产物，c自连产物，c与a,b之一自连产物，可借助质粒完整性与否，抗性，特异基因，重组子大小 ...

谢谢，我也是想应该能筛选出来，就是怕小片段好连，练出来全是载体跟载体的连接产物
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22楼2014-10-27 11:45:34
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zrj123456

新虫 (小有名气)
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20楼: Originally posted by 小T在努力！ at 2014-10-27 10:44:33
清洁是什么。。。求科普。用试剂盒回收重复最后一步还是没问题的。可以测一下回收产物的od，再确定连接反应体系中片段的量啊！

清洁就是用试剂盒过下柱子，把产物内的除了核酸之外的酶和离子去掉，防止影响下一步反应，我是测了OD的程序直接给浓度
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23楼2014-10-27 11:47:10
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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22楼: Originally posted by zrj123456 at 2014-10-27 11:45:34
谢谢，我也是想应该能筛选出来，就是怕小片段好连，练出来全是载体跟载体的连接产物...

恩，这就需要大批量的挑克隆，一遍一遍筛选重组子了！

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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
24楼2014-10-27 12:15:06
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zrj123456

新虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by yudaoqian88 at 2014-10-27 12:15:06
恩，这就需要大批量的挑克隆，一遍一遍筛选重组子了！
...

恩，我不怕，只要能做出结果，就是怕出不来结果啊
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25楼2014-10-27 12:20:17
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
25楼: Originally posted by zrj123456 at 2014-10-27 12:20:17
恩，我不怕，只要能做出结果，就是怕出不来结果啊...

其实，单纯的回收量小，楼主可以扩大体系回收，尽量避免这种复杂的方法，我是当时连接启动子连不上，才用这种笨方法的！

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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
26楼2014-10-27 12:25:50
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zrj123456

新虫 (小有名气)
引用回帖:
26楼: Originally posted by yudaoqian88 at 2014-10-27 12:25:50
其实，单纯的回收量小，楼主可以扩大体系回收，尽量避免这种复杂的方法，我是当时连接启动子连不上，才用这种笨方法的！
...

好像不仅是回收量小，同实验室师兄师姐都说胶回收后酶连效率很低，很少有连上的，不知道是经验还是真的实验室仪器，胶有问题
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27楼2014-10-27 16:50:51
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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27楼: Originally posted by zrj123456 at 2014-10-27 16:50:51
好像不仅是回收量小，同实验室师兄师姐都说胶回收后酶连效率很低，很少有连上的，不知道是经验还是真的实验室仪器，胶有问题...

我连启动子是这样的，但连基因貌似影响也不大，可能真的有影响吧！

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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
28楼2014-10-27 18:14:53
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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15楼: Originally posted by zrj123456 at 2014-10-27 08:30:38
为什么不太好连上？不是有粘性末端吗？现在我已经做了三批了，每次连假阳性的都没有长出来，转化后的板子特别干净！！！所以才想着这样做，会不会是浓度太低的原因了，我的载体每次都去磷酸化...

单酶切之后直接连接不会自连吗
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29楼2014-10-27 18:52:03
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393658000

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-30 19:15:58
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21楼: Originally posted by zrj123456 at 2014-10-27 10:58:26
谢谢您，我不太明白您说的3末端比5末端难连是什么情况？我做了几次胶回收用20微升去离子水回收，浓度都只是30ng/μl左右，目的片段是8kb，载体5kb，连了几次，都是连假阳性都没有，不知道什么情况，感受态实验室都 ...

你找一本NEB的书就可以知道了，3‘末端突出比5’末端突出会难连很多；至于你说的目的片段8KB，载体5KB，你不妨反过来用，8KB的当做载体，5KB 当做片段，然后去算下比例，按比例连接吧，4度过夜连；最后感受态的问题，你这质粒加起来13K了，不知道你是何种感受态，找个效率高点的转化吧。
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30楼2014-10-28 10:58:02
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