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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » GST融合蛋白包涵体如何纯化？
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jza63

铁虫 (初入文坛)

[求助] GST融合蛋白包涵体如何纯化？ 已有3人参与

这是我诱导后跑的蛋白电泳图，第一个蛋白大概100KD左右（第2泳道），第二个蛋白大概70KD（第9个泳道），这两个都是GST标签蛋白，经细胞破碎验证后发现这两个蛋白都是在包涵体中，不是在上清里，诱导条件是：37℃，5h,140rpm。。。 请问我该怎么改变条件能够使他们能在上清中表达，就是能够分泌表达；或者GST标签蛋白在包涵体中的话该怎么去纯化，非常感谢，急用，谢谢

GST融合蛋白包涵体如何纯化？
菌.png
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1楼 2014-09-28 23:04:48
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jza63

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wxy_0808 at 2014-09-29 00:24:15
大肠杆菌中表达gst蛋白一般都是包涵体，你一般破碎后，10000g离心去细胞碎片，上清上蛋白质纯化仪（gst亲和层析柱），酶切，紫外检测收集，即可，后续可以sds-page检测下分离纯化效果。
我是这么做的，你再看看还有 ...

破碎后上清中没有蛋白，都在包涵体中，就是在破碎后的沉淀中，不知道该用什么方法去从包涵体中纯化出蛋白
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3楼2014-09-30 09:03:03
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wxy_0808

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助！ 2014-11-19 09:21:48
大肠杆菌中表达gst蛋白一般都是包涵体，你一般破碎后，10000g离心去细胞碎片，上清上蛋白质纯化仪（gst亲和层析柱），酶切，紫外检测收集，即可，后续可以sds-page检测下分离纯化效果。
我是这么做的，你再看看还有没有更好的办法。

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-09-29 00:24:15
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super_mm

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1. 想要增加目的蛋白的溶解度，可以降低诱导温度30度 25度 22度试试，或者适当降低IPTG的浓度。
2. 包涵体蛋白更好纯化啊，不过看你的包涵体杂蛋白挺多，超声破碎的力度好像不大够啊，首先洗涤包涵体，你的缓冲液中加2M尿素，重悬下沉淀洗一洗后离心，然后溶解包涵体，用buffer加6-8M尿素重悬包涵体，最好过夜搅拌溶解，然后按照gst标签蛋白纯化方法纯化就行，只是所有溶液中都加上6-8M尿素，纯化以后再想办法复性，去除尿素保持目的蛋白的活性。
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4楼2014-10-13 10:18:19
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jza63

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by super_mm at 2014-10-13 10:18:19
1. 想要增加目的蛋白的溶解度，可以降低诱导温度30度 25度 22度试试，或者适当降低IPTG的浓度。
2. 包涵体蛋白更好纯化啊，不过看你的包涵体杂蛋白挺多，超声破碎的力度好像不大够啊，首先洗涤包涵体，你的缓冲液中 ...

我的诱导温度已经降到17℃了，还是只在包涵体中表达，感觉可能是因为蛋白分子量比较大，不好分泌表达。GST的蛋白包涵体溶解一般是在盐酸胍中吧，尿素的话对于上柱是有影响的，现在在尝试用SDS溶解，请问您对蛋白复性方面有什么见解，现在在发愁复性的问题，不知道如何配制复性液
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5楼2014-10-13 19:12:16
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