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jza63

铁虫 (初入文坛)

[求助] GST融合蛋白包涵体如何纯化? 已有3人参与

这是我诱导后跑的蛋白电泳图,第一个蛋白大概100KD左右(第2泳道),第二个蛋白大概70KD(第9个泳道),这两个都是GST标签蛋白,经细胞破碎验证后发现这两个蛋白都是在包涵体中,不是在上清里,诱导条件是:37℃,5h,140rpm。。。 请问我该怎么改变条件能够使他们能在上清中表达,就是能够分泌表达;或者GST标签蛋白在包涵体中的话该怎么去纯化,非常感谢,急用,谢谢

GST融合蛋白包涵体如何纯化?
菌.png
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wxy_0808

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助! 2014-11-19 09:21:48
大肠杆菌中表达gst蛋白一般都是包涵体,你一般破碎后,10000g离心去细胞碎片,上清上蛋白质纯化仪(gst亲和层析柱),酶切,紫外检测收集,即可,后续可以sds-page检测下分离纯化效果。
我是这么做的,你再看看还有没有更好的办法。

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-09-29 00:24:15
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jza63

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wxy_0808 at 2014-09-29 00:24:15
大肠杆菌中表达gst蛋白一般都是包涵体,你一般破碎后,10000g离心去细胞碎片,上清上蛋白质纯化仪(gst亲和层析柱),酶切,紫外检测收集,即可,后续可以sds-page检测下分离纯化效果。
我是这么做的,你再看看还有 ...

破碎后上清中没有蛋白,都在包涵体中,就是在破碎后的沉淀中,不知道该用什么方法去从包涵体中纯化出蛋白
3楼2014-09-30 09:03:03
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super_mm

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1. 想要增加目的蛋白的溶解度,可以降低诱导温度30度 25度 22度试试,或者适当降低IPTG的浓度。
2. 包涵体蛋白更好纯化啊,不过看你的包涵体杂蛋白挺多,超声破碎的力度好像不大够啊,首先洗涤包涵体,你的缓冲液中加2M尿素,重悬下沉淀洗一洗后离心,然后溶解包涵体,用buffer加6-8M尿素重悬包涵体,最好过夜搅拌溶解,然后按照gst标签蛋白纯化方法纯化就行,只是所有溶液中都加上6-8M尿素,纯化以后再想办法复性,去除尿素保持目的蛋白的活性。
4楼2014-10-13 10:18:19
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jza63

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by super_mm at 2014-10-13 10:18:19
1. 想要增加目的蛋白的溶解度,可以降低诱导温度30度 25度 22度试试,或者适当降低IPTG的浓度。
2. 包涵体蛋白更好纯化啊,不过看你的包涵体杂蛋白挺多,超声破碎的力度好像不大够啊,首先洗涤包涵体,你的缓冲液中 ...

我的诱导温度已经降到17℃了,还是只在包涵体中表达,感觉可能是因为蛋白分子量比较大,不好分泌表达。GST的蛋白包涵体溶解一般是在盐酸胍中吧,尿素的话对于上柱是有影响的,现在在尝试用SDS溶解,请问您对蛋白复性方面有什么见解,现在在发愁复性的问题,不知道如何配制复性液
5楼2014-10-13 19:12:16
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chenyuanxmc

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

可以尝试在低温,低诱导剂条件下,与伴侣蛋白共表达
6楼2014-11-16 22:10:37
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分子白痴

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by super_mm at 2014-10-13 10:18:19
1. 想要增加目的蛋白的溶解度,可以降低诱导温度30度 25度 22度试试,或者适当降低IPTG的浓度。
2. 包涵体蛋白更好纯化啊,不过看你的包涵体杂蛋白挺多,超声破碎的力度好像不大够啊,首先洗涤包涵体,你的缓冲液中 ...

请问有没有具体的纯化流程啊?急需啊,拜托拜托啊!
7楼2016-05-09 22:11:32
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