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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 换载体，pET21a换成pET32a的酶切位点问题
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蠹鱼

木虫 (正式写手)

[求助] 换载体，pET21a换成pET32a的酶切位点问题 已有4人参与

用Nde I 和Hind III 双酶切目的片段以及空载体pET21a，构建了一个重组质粒来表达一个酶，但是至今未表达。可能是那是出现了问题呢？
        我想换个载体，用pET32试一下。Hind III 只有一个酶切位点，可以沿用。但是pET32上有2个Nde I 的切割位点，这样可以吗？会不会切的乱七八糟的？应不应该设计引物，PCR重新构建酶切位点呢？
        刚刚进实验室，恳请大家多多指点。
        另外，我还想换成pBAD质粒，这个酶切位点怎么选，怎么办？
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少一分浮躁，多一分踏实。少一分侥幸，多一分努力。
1楼 2014-09-28 17:07:55
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cuihao102

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-28 18:49:15
蠹鱼: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-09-28 19:11:39
未表达可能原因宿主菌BL21（DE3）是否正常、诱导条件是否为最优、基因内部是否有稀有密码子。
换32a就不能用Nde I了，需要重新设计引物，酶切位点可以换成NcoI或者BamHI。另外，pBAD系列的载体酶切位点也不一样啊
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2楼2014-09-28 18:09:55
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zdd2008
3楼2014-09-28 18:29:14
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蠹鱼

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cuihao102 at 2014-09-28 18:09:55
未表达可能原因宿主菌BL21（DE3）是否正常、诱导条件是否为最优、基因内部是否有稀有密码子。
换32a就不能用Nde I了，需要重新设计引物，酶切位点可以换成NcoI或者BamHI。另外，pBAD系列的载体酶切位点也不一样啊

宿主菌BL21（DE3）是正常的，没有稀有密码子。诱导条件没有做出优化。期待您的进一步回答
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少一分浮躁，多一分踏实。少一分侥幸，多一分努力。
4楼2014-09-28 19:12:47
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cuihao102

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
蠹鱼: 金币+1 2014-09-29 15:37:18
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-30 18:33:38
首先做个验证，最好是测序，看看构建的质粒是不是和预期的一致。如果都没错就应该摸索一下诱导条件，一般包括：IPTG浓度、诱导时间、诱导温度。
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5楼2014-09-28 19:49:06
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可帅儿

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蠹鱼: 金币+1 2014-09-29 15:38:01
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-09-30 18:33:59
只要你加了NdeI那2个位点都会切开~你上网查查载体图谱，看下有其他共用位点没？
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追随自己的心！不要做让自己后悔的事！
6楼2014-09-29 13:46:31
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蠹鱼

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cuihao102 at 2014-09-28 19:49:06
首先做个验证，最好是测序，看看构建的质粒是不是和预期的一致。如果都没错就应该摸索一下诱导条件，一般包括：IPTG浓度、诱导时间、诱导温度。

测序显示符合
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少一分浮躁，多一分踏实。少一分侥幸，多一分努力。
7楼2014-09-29 15:37:11
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蠹鱼

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 可帅儿 at 2014-09-29 13:46:31
只要你加了NdeI那2个位点都会切开~你上网查查载体图谱，看下有其他共用位点没？

结果是什么样子，不可行？
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少一分浮躁，多一分踏实。少一分侥幸，多一分努力。
8楼2014-09-29 15:37:43
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jian212

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-09-30 18:34:09
换成PET-32的话位点可以用的。
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学习再学习，努力再努力。
9楼2014-09-29 15:39:44
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jian212

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-30 18:34:16
测序没问题换个载体的话估计也没什么多大用处，还是建议摸索一下诱导条件。重新转化下感受态细胞。
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学习再学习，努力再努力。
10楼2014-09-29 15:42:28
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