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[求助] 换载体，pET21a换成pET32a的酶切位点问题已有4人参与

用Nde I 和Hind III 双酶切目的片段以及空载体pET21a，构建了一个重组质粒来表达一个酶，但是至今未表达。可能是那是出现了问题呢？
      我想换个载体，用pET32试一下。Hind III 只有一个酶切位点，可以沿用。但是pET32上有2个Nde I 的切割位点，这样可以吗？会不会切的乱七八糟的？应不应该设计引物，PCR重新构建酶切位点呢？
      刚刚进实验室，恳请大家多多指点。
      另外，我还想换成pBAD质粒，这个酶切位点怎么选，怎么办？

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1楼 2014-09-28 17:07:55

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cuihao102

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【答案】应助回帖

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-28 18:49:15
蠹鱼: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-09-28 19:11:39

未表达可能原因宿主菌BL21（DE3）是否正常、诱导条件是否为最优、基因内部是否有稀有密码子。
换32a就不能用Nde I了，需要重新设计引物，酶切位点可以换成NcoI或者BamHI。另外，pBAD系列的载体酶切位点也不一样啊

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2楼2014-09-28 18:09:55

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zdd2008

3楼2014-09-28 18:29:14

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引用回帖:

2楼: Originally posted by cuihao102 at 2014-09-28 18:09:55
未表达可能原因宿主菌BL21（DE3）是否正常、诱导条件是否为最优、基因内部是否有稀有密码子。
换32a就不能用Nde I了，需要重新设计引物，酶切位点可以换成NcoI或者BamHI。另外，pBAD系列的载体酶切位点也不一样啊

宿主菌BL21（DE3）是正常的，没有稀有密码子。诱导条件没有做出优化。期待您的进一步回答

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少一分浮躁，多一分踏实。少一分侥幸，多一分努力。

4楼2014-09-28 19:12:47

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