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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)

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[求助] 这样的引物能做荧光定量PCR吗？已有3人参与

图为荧光定量引物的验证。从左到右依次为Marker DL5000、引物1、引物2、内参GAPDH。虽说目的条带跑出来了，但最下方引物二聚体也很明显，包括内参也存在引物二聚体，三对引物PCR反应的退火温度分别为53℃、55℃、57℃，后来又试着把三对的退火温度统一设为60℃，依旧出现引物二聚体。这种情况下引物还能用做荧光定量PCR吗？
引物具体信息如下：（1-F %GC为40%，TM值为53.7；1-R %GC为40%，TM值为53.7）；（2-F %GC为45%，TM值为55.8；2-R %GC为40%，TM值为53.7）；（GAPDH-F %GC为61.1%，TM值为59.6；GAPDH-R %GC为50%，TM值为57.8.）

20140912.jpg

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在学术的汪洋里，扑腾。

1楼 2014-09-14 16:52:49

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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)

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引用回帖:

3楼: Originally posted by dxh86412 at 2014-09-15 00:24:15
最好能够没有二聚体，因为二聚体主要影响扩增效率，但是如果没办法的话，方便的话做个标准曲线看下扩增效率怎么样，如果在95-105%之间，那用来做定量肯定没问题，如果太低或太高，就只能重新设计了。还有你也可以提 ...

我也提高过退火温度，60度，但是还是出现了二聚体。头疼，荧光定量我没做过，好难啊。