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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 这样的引物能做荧光定量PCR吗？
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)

[求助] 这样的引物能做荧光定量PCR吗？ 已有3人参与

图为荧光定量引物的验证。从左到右依次为Marker DL5000、引物1、引物2、内参GAPDH。虽说目的条带跑出来了，但最下方引物二聚体也很明显，包括内参也存在引物二聚体，三对引物PCR反应的退火温度分别为53℃、55℃、57℃，后来又试着把三对的退火温度统一设为60℃，依旧出现引物二聚体。这种情况下引物还能用做荧光定量PCR吗？
引物具体信息如下：（1-F %GC为40%，TM值为53.7；1-R %GC为40%，TM值为53.7）；（2-F %GC为45%，TM值为55.8；2-R %GC为40%，TM值为53.7）；（GAPDH-F %GC为61.1%，TM值为59.6；GAPDH-R %GC为50%，TM值为57.8.）

这样的引物能做荧光定量PCR吗？
20140912.jpg
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在学术的汪洋里，扑腾。
1楼 2014-09-14 16:52:49
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-14 23:50:11
赵晓楠zxn: 金币+3, ★有帮助 2014-09-15 17:05:10
没有杂带理论上可以做定量的，再重新设计一下退火温度就好了，引物二聚体的出现很大程度是因为退火温度不合适……住顺利！
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
2楼2014-09-14 18:31:04
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dxh86412

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
赵晓楠zxn: 金币+5, ★有帮助 2014-09-15 08:40:43
最好能够没有二聚体，因为二聚体主要影响扩增效率，但是如果没办法的话，方便的话做个标准曲线看下扩增效率怎么样，如果在95-105%之间，那用来做定量肯定没问题，如果太低或太高，就只能重新设计了。还有你也可以提高退火温度试试，一般都要在60左右的~
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3楼2014-09-15 00:24:15
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by dxh86412 at 2014-09-15 00:24:15
最好能够没有二聚体，因为二聚体主要影响扩增效率，但是如果没办法的话，方便的话做个标准曲线看下扩增效率怎么样，如果在95-105%之间，那用来做定量肯定没问题，如果太低或太高，就只能重新设计了。还有你也可以提 ...

我也提高过退火温度，60度，但是还是出现了二聚体。头疼，荧光定量我没做过，好难啊。
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4楼2014-09-15 08:42:55
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
赵晓楠zxn: 金币+2, ★有帮助 2014-09-15 17:05:16
引物二聚体产生本底荧光，减少用量就行。
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5楼2014-09-15 12:39:20
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-09-15 12:39:20
引物二聚体产生本底荧光，减少用量就行。

不是说引物二聚体影响扩增效率吗，你的意思是减少引物的用量吗？
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6楼2014-09-15 17:04:48
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running113

木虫 (著名写手)
可以先做一下，看条带效果还是可以的。

[ 发自小木虫客户端 ]
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SCI我来了！！！
7楼2014-09-15 17:35:04
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 赵晓楠zxn at 2014-09-15 17:04:48
不是说引物二聚体影响扩增效率吗，你的意思是减少引物的用量吗？...

减少引物。引物二聚体其实可以增加PCR的特异性
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8楼2014-09-16 08:52:43
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)
胶图上的电泳结果你是不是采用常规的Taq酶，如果是的话，建议你采用荧光定量的Mix做个PCR，跑胶看一下，因为大部分的荧光定量的Mix中是使用的热启动酶，这很好的减少引物二聚体的生成和非特异性扩增。
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赵晓楠zxn
rainwater
9楼2014-09-17 08:44:51
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-09-17 08:44:51
胶图上的电泳结果你是不是采用常规的Taq酶，如果是的话，建议你采用荧光定量的Mix做个PCR，跑胶看一下，因为大部分的荧光定量的Mix中是使用的热启动酶，这很好的减少引物二聚体的生成和非特异性扩增。

是的，我是先用普通PCR的Taq酶扩的。很有帮助，谢谢。
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10楼2014-09-20 18:33:31
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