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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 分子克隆连接验证问题
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五维度的爱

金虫 (小有名气)

[求助] 分子克隆连接验证问题 已有4人参与

最近把所克隆的目的基因连接到pET-28a载体上，转化后挑菌用载体的通用引物验证不出来，但用特异性的引物能够验证出目的基因，但测序时总是无信号，这个该怎么解？
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1楼 2014-09-09 12:32:38
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jinshengfang

木虫 (正式写手)
我觉得可能没有连接上去，因为单菌做pcr本来就不准确。特异性引物可能只是pcr出的游离片段。
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生物催化
7楼2014-11-05 19:38:51
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qapollo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以尝试扩增出目的基因后，PCR产物测序
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2楼2014-09-09 12:52:49
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-09 18:11:11
五维度的爱: 金币+1, ★有帮助 2014-09-09 20:51:13
楼主测序的时候用的通用引物还是特异性引物???如果是通用引物那就正常了,你用通用引物没有P出来，再测序也有问题，有可能是pET-28a载体有问题！楼主可以用双酶切产物或则特异性引物的PCR产物去测序，如果正确说明你目的片断连接上去了，但是你的载体有问题，那就只能从新弄个载体从新连接了！
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3楼2014-09-09 13:08:03
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bwangel

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by qapollo at 2014-09-09 12:52:49
可以尝试扩增出目的基因后，PCR产物测序

这样测序目的序列不全
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4楼2014-09-09 16:03:43
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