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五维度的爱

金虫 (小有名气)

[求助] 分子克隆连接验证问题 已有4人参与

最近把所克隆的目的基因连接到pET-28a载体上,转化后挑菌用载体的通用引物验证不出来,但用特异性的引物能够验证出目的基因,但测序时总是无信号,这个该怎么解?
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qapollo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以尝试扩增出目的基因后,PCR产物测序
2楼2014-09-09 12:52:49
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-09-09 18:11:11
五维度的爱: 金币+1, 有帮助 2014-09-09 20:51:13
楼主测序的时候用的通用引物还是特异性引物???如果是通用引物那就正常了,你用通用引物没有P出来,再测序也有问题,有可能是pET-28a载体有问题!楼主可以用双酶切产物或则特异性引物的PCR产物去测序,如果正确说明你目的片断连接上去了,但是你的载体有问题,那就只能从新弄个载体从新连接了!
3楼2014-09-09 13:08:03
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bwangel

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by qapollo at 2014-09-09 12:52:49
可以尝试扩增出目的基因后,PCR产物测序

这样测序目的序列不全
4楼2014-09-09 16:03:43
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bwangel

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
载体的问题,是否把载体弄错了?对应载体的通用引物是肯定能扩出来的
5楼2014-09-09 16:05:07
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五维度的爱

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by qapollo at 2014-09-09 12:52:49
可以尝试扩增出目的基因后,PCR产物测序

但是不能确定载体是否有问题
6楼2014-09-09 20:53:33
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jinshengfang

木虫 (正式写手)

我觉得可能没有连接上去,因为单菌做pcr本来就不准确。特异性引物可能只是pcr出的游离片段。
生物催化
7楼2014-11-05 19:38:51
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

反向测,如果正向没信号

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-11-05 21:05:10
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