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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接转化问题
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hj890509

金虫 (正式写手)

[求助] 连接转化问题 已有6人参与

表达载体连接片段转化后不长菌落，转质粒验证过感受态细胞没有问题，配置的平板也没有问题，表达载体用AvrII和SnaBI双酶切，一个是粘性末端，另一个是平末端，目的片段是用相同的酶从T载体上切下来回收的，载体9.3kb，目的片段4.4kb，摩尔比为1:3,1:5,1:8都做过，用NEB的T4连接酶22度连接2h后转化的，也做过其他时间，求各位虫友们帮忙分析分析，谢啦
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1楼 2014-09-02 14:28:59
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-02 15:27:10
hj890509: 金币+2, ★有帮助 2014-09-03 10:23:21
亲，这个问题不是载体的问题，是表达菌落的问题，建议你换一种感受态试试。
也有人说转化时摇菌时间长一点，2个小时左右
连接时间也适当长一些
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2楼2014-09-02 14:50:24
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普通回帖

111111111118

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hj890509: 金币+5, ★有帮助 2014-09-11 14:58:38
对于涉及到平末端的克隆， 建议你看看另一个帖子和相关论文：

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7727916

应该还是很有帮助的， 毕竟平末端克隆的难度大一些， 得需要点特殊处理， 希望能有帮助！
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3楼2014-09-02 16:18:50
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-03 18:46:01
hj890509: 金币+2, ★有帮助 2014-09-11 14:59:01
平末端连接比较困难,除了加连接酶,整个体系里面还要加特殊Buffer！可以买点专门连接平末端酶！
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4楼2014-09-02 17:22:34
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hj890509

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by huyan0817 at 2014-09-02 17:22:34
平末端连接比较困难,除了加连接酶,整个体系里面还要加特殊Buffer！可以买点专门连接平末端酶！

我们之前连接的两端都是平末端的还好啊，是不是一端平末端一端粘性末端会更难连接？
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5楼2014-09-03 09:43:43
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hj890509

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by happydove at 2014-09-02 14:50:24
亲，这个问题不是载体的问题，是表达菌落的问题，建议你换一种感受态试试。
也有人说转化时摇菌时间长一点，2个小时左右
连接时间也适当长一些

可是之前用该载体连别的基因，两边都是粘性末端的时候就很好连接啊，表达菌落应该没有问题。
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6楼2014-09-03 10:23:10
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生物小学渣

新虫 (初入文坛)
亲，我也要用这两个酶做双酶切，麻烦问一下，你是用的什么体系，和时间？因为snabI酶里带了一份0.1%的BSA，可是avrII是没有的。我是新手，不知道怎么办了？谢谢
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7楼2014-10-05 14:49:58
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zergbloody

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

楼主建议你把质粒载体测浓度稀释至十几ng/微升 然后把前段按比例稀释十倍 五十倍 一百倍 再连接 用16度连接过夜 效果比较好

[ 发自小木虫客户端 ]
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8楼2014-10-07 08:29:28
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zergbloody

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hj890509: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2014-10-08 08:41:35
哦 对了 使用十微升体系 载体加0.5 片段加2即可 其他按量加 补水至10

[ 发自小木虫客户端 ]
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9楼2014-10-07 08:31:22
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hj890509

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 生物小学渣 at 2014-10-05 14:49:58
亲，我也要用这两个酶做双酶切，麻烦问一下，你是用的什么体系，和时间？因为snabI酶里带了一份0.1%的BSA，可是avrII是没有的。我是新手，不知道怎么办了？谢谢

体系就按说明书里的，我用的是NEB的酶，用Cutsmart缓冲液，不需要加0.1%的BSA，酶切两个小时就够了
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10楼2014-10-08 08:40:52
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