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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 克隆时卡那筛选菌落
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lihuahan

银虫 (初入文坛)

[求助] 克隆时卡那筛选菌落 已有2人参与

各位大侠，最近在做表达载体的转化，转化后涂完含卡那霉素（终浓度50ug/ml）的板，37°培养12h后长了3个菌，想着有可能是培养时间不够，又放进去培养了3h，总共15h，长出很多小菌，那3个菌长得较大，就挑菌后（挑的中等大小菌落）又过夜摇菌，挑了20个总共只摇出来1个，但没摇出来的做了pcr验证后又有目的条带，这是什么原因尼？验证了抗生素没问题，感受态没问题，是因为卡那加的太多吗？急等~~~~~~
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1楼 2014-07-29 08:11:27
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lihuahan(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-31 18:21:08
一般生长12-16h，再多了就只能挑大点的单克隆，小点的不要挑，时间太长抗生素可能失效了。
摇菌一般摇10h左右就能摇起来，没摇起来的要不就是放的不好或者是假的。
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3楼2014-07-29 15:32:08
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xzy0425

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-29 11:57:56
不是因为卡那加多了，而是菌株生长缓慢。这一点可以从你的平板看出来，12小时只长了三个菌落，而15小时长了很多菌落。挑斑摇菌后，只摇出一个，而其他试管中PCR检测含有目的基因，说明也是含有菌落的，只是浓度太低看不清罢了，可以适当延长摇菌的时间。
受体菌与载体之间有亲缘性的关系，对载体进行改造后，会发生亲缘性的改变，亲缘性高，载体拷贝快，受体菌生长就快，反之亦然。我在实验中也遇到过这样的问题，就是通过适当延长时间来解决的，这个跟抗生素浓度无关。
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2楼2014-07-29 10:05:17
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lihuahan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xzy0425 at 2014-07-29 10:05:17
不是因为卡那加多了，而是菌株生长缓慢。这一点可以从你的平板看出来，12小时只长了三个菌落，而15小时长了很多菌落。挑斑摇菌后，只摇出一个，而其他试管中PCR检测含有目的基因，说明也是含有菌落的，只是浓度太低 ...

我后期又做了一遍菌液pcr，结果都没p出来…摇菌摇出来的那管也没有额，都没转化进去吗？质粒加了200ng

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-07-29 17:30:57
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lihuahan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-07-29 15:32:08
一般生长12-16h，再多了就只能挑大点的单克隆，小点的不要挑，时间太长抗生素可能失效了。
摇菌一般摇10h左右就能摇起来，没摇起来的要不就是放的不好或者是假的。

我也觉得是有问题尼，菌大小差距还挺大，我的平板是4天前制好放在四度冰箱的，应该问题不大吧？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2014-07-29 17:32:14
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