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wyf625356

铁虫 (小有名气)

[求助] taqman探针进行荧光定量PCR结果分析 已有2人参与

我需要扩增的DNA序列是CACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCGAATTCGAGCTC(125bp)
设计的引物及探针如下
PRIMER  F:         CACGCGGTTCTGGTATGA(18bp)
PRIMER  R:         GAGCTCGAATTCGGATCC (18bp)
taqman探针(报告基团JOE)        CCGCTGCTGCTAAATTCGAAC    (21bp)

实时荧光定量pcr扩增条件
93℃   120s
93℃   10s
60℃  30s,cycles45

但是结果如图1,没有明显的荧光对数增长曲线


我跑琼脂糖凝胶电泳,图2结果,1是marker,2是探针,3,是Taqman的扩增结果4,是常规PCR结果

其中第三道有杂条带,大家帮我分析一下,没有荧光的原因

taqman探针进行荧光定量PCR结果分析
fig.1.png


taqman探针进行荧光定量PCR结果分析-1
fig.2.jpg
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vege的桌子

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
探针的TM值比引物高多少?
2楼2014-07-23 16:31:47
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wyf625356

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by vege的桌子 at 2014-07-23 16:31:47
探针的TM值比引物高多少?

引物是61.3,61.1,探针是69.7
3楼2014-07-24 14:01:29
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引物偏短,我的软件预测你的引物Tm在54℃、56℃,Tm低。
4楼2014-07-24 17:46:00
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wyf625356

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-24 17:46:00
引物偏短,我的软件预测你的引物Tm在54℃、56℃,Tm低。

可是我扩增条带,跑胶是有的目的条带的;另外我自己的软件温度是有60℃的
5楼2014-07-25 09:12:24
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

引用回帖:
5楼: Originally posted by wyf625356 at 2014-07-25 09:12:24
可是我扩增条带,跑胶是有的目的条带的;另外我自己的软件温度是有60℃的...

你用55℃退火条件看看
6楼2014-07-25 11:11:20
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syy5840

新虫 (初入文坛)

请问问题解决没有,我也遇到了同样的问题,恳请楼主给予帮助!
7楼2016-12-24 13:44:16
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永不言弃!!

铜虫 (初入文坛)

拒绝长大但要不断成长
8楼2019-08-27 13:45:33
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