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流式细胞仪实验方法和Bio-Rad荧光定量PCR应用指南完整版
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流式细胞仪实验方法 一、 实验准备 1． 标本制备： 2． 最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI 染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL 法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病 目录 1. 荧光定量PCR概述 2 1.1 荧光定量PCR的主要概念 2 1.1.1 什么是荧光定量PCR? 2 1.1.2 荧光定量PCR工作原理 3 1.1.3 优化的qPCR 实验特点 4 2. 实验开始 8 2.1 总体注意事项 8 2.2 qPCR实验设计注意事项 9 2.2.1 单重实验或多重实验?9 2.2.2 方法选择 9 2.2.2.1 DNA 结合染料 10 2.2.2.2 基于荧光标记的引物或探针的化学机理 12 2.3 SYBR Green I 反应设计及优化 19 2.3.1 引物和扩增子的设计 19 2.3.2 实验体系的确定及优化 20 2.3.2.1 退火温度的优化 20 2.3.2.2 用标准曲线进行反应的评估 22 2.4 TaqMan 探针反应设计及优化 23 2.4.1 引物和探针设计 23 2.4.2 实验体系的确定及优化 24 3. 多重实验注意事项 28 3.1 多重实验的引物及探针设计 28 3.2 多重实验的报告基团和淬灭基团选择 29 3.3 多重实验前单个实验的优化 29 3.4 多重实验的验证 29 3.5 多重实验的优化 30 目录 4. 荧光定量PCR数据分析 34 4.1 绝对定量 35 4.1.1 什么时候使用绝对定量? 35 4.1.2 使用标准曲线进行绝对定量 35 4.2 相对定量 37 4.2.1 什么时候使用相对定量 37 4.2.2 用质量单位作为标准进行相对定量 38 4.2.3 用参照基因作为标准进行相对定量 40 4.2.3.1 2 –∆∆C T (Livak) 方法 41 4.2.3.2 用参照基因的∆C T 法 42 4.2.3.3 Pfaffl 方法 43 5. 基因表达分析 46 5.1 实验设计 46 5.2 RNA 分离 47 5.2.1 样品收集 47 5.2.2 RNA 提取 48 5.2.3 检测核酸的质量和数量 48 5.3 cDNA 模板的制备(反转录) 49 5.4 qPCR 实验方法选择 50 5.5 应用举例 51 5.5.1 多重分析的反应组分 51 5.5.2 循环条件 51 5.6 基因表达数据分析 52 6. 基因型/等位基因分析 54 6.1 实验设计 55 6.2 使用TaqMan 方法设计引物和探针 56 6.3 DNA 提取和样品处理 57 6.4 TaqMan探针实验的反应组分 58 6.5 实验优化 59 6.6 TaqMan探针实验的循环条件 59 6.7 等位基因分析的数据处理 59 6.7.1 等位基因分析的结果验证 59 6.7.2 基因型识别 72 |
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