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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » CTAB法提DNA，沉淀DNA有漂亮的絮状物，提取完电泳却什么都没有，大家来帮帮忙
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wuweifeng710

木虫 (正式写手)

[求助] CTAB法提DNA，沉淀DNA有漂亮的絮状物，提取完电泳却什么都没有，大家来帮帮忙 已有8人参与

最近一直在用CTAB法提DNA，沉淀DNA有漂亮的絮状物，用75%的乙醇洗沉淀2次，用TE溶解后，37摄氏度水浴30min，表现为溶液粘稠，完后电泳却什么都没有，连点样孔都没有亮，估计是多糖污染，但为什么点样孔一点亮都没有，有点marker，marker表现很正常，我沉淀完dna的后续操作是这样的
1.用异丙醇沉淀DNA，出现絮状物（有用过无水乙醇沉淀，也是有沉淀，电泳完什么也没看到），4℃下5000rpm离心5分钟
2.弃上清，用75%乙醇洗沉淀，5000rpm离心1min，重复1次
3.在超净工作台抽干乙醇（大约15分钟左右）
4.TE溶解，加少许RNase水浴30~60min
5.跑胶（有尝试水浴完直接跑胶，也有在室温下或4℃下过夜后跑胶）
大家来帮帮忙！帮我找找原因，谢谢大家了
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1楼 2014-07-22 19:40:59
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逍遥e宝

铁杆木虫 (正式写手)

我爱黄赌毒

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-23 12:10:30
乙醇漂洗就洗洗表面即可，不需要把沉淀吹散离心的~~或者，你用TE和RNase除完rna后用 30μl  3M  NaAc（PH=5.2）,1 ml  无水乙醇的混合物 -20℃ 1h  沉淀下 DNA  。沉淀 4℃离心15min  12000转。然后再用 TE  溶解 试试
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无数老鼠的生命祭奠了我被偷走的那五年---------------forever宝
10楼2014-07-23 09:51:40
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-23 12:10:04
TE溶解或RNase处理之后有测浓度么？是否正常？
TE溶液是新配制的么？pH还正常不？
你提的是植物细胞么？CTAB提出来的DNA很容易成团，不易溶解，可以试试增加溶解时间。能够看到絮状或丝状说明DNA沉淀是没问题的，建议之前提的DNA如果没有扔掉的话在37°多放几天，然后再跑一下胶试试。
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
6楼2014-07-23 02:30:05
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njtx888

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-25 13:50:46
你好！用CTAB法提取DNA的过程中钠离子浓度必须大于1mol/L，否则DNA与CTAB、杂质共沉淀，产生絮状并且上清中回收不到DNA，我估计你的裂解液中钠离子浓度不足，需要加入氯化钠，这些都是经验之谈，记得给红花啊，谢谢！
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14楼2014-07-24 13:12:56
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普通回帖

幺哥撸啊撸

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wuweifeng710(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:40:47
我觉得有可能是材料不够，还有就是蛋白质去除不干净，你换苯酚-氯仿-异戊醇试试。
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2楼2014-07-22 20:33:46
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wuweifeng710(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-23 12:04:43
如果有漂亮的絮状物，直接用牙签挑出，70%乙醇洗一次，离心，风干，充分溶解，测浓度+电泳，再试试。
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3楼2014-07-22 20:58:32
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wuweifeng710

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 幺哥撸啊撸 at 2014-07-22 20:33:46
我觉得有可能是材料不够，还有就是蛋白质去除不干净，你换苯酚-氯仿-异戊醇试试。

我有专门称量一下，１．５ｍｌ的ＥＰ管，大约０．１ｇ的量，且有用酚－氯仿－异戊醇
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4楼2014-07-22 21:34:04
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wuweifeng710

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by stone2239 at 2014-07-22 20:58:32
如果有漂亮的絮状物，直接用牙签挑出，70%乙醇洗一次，离心，风干，充分溶解，测浓度+电泳，再试试。

这个办法试过，有条带，但用75%乙醇洗的，跑出来的结果不理想
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5楼2014-07-22 21:35:31
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三蛰

铜虫 (小有名气)
★
wuweifeng710(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-23 12:10:19
离完心能看到白色沉淀不？我怀疑你是在用乙醇洗脱的时候，把dna倒掉了。。。很多时候不注意就把它倒掉了。
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我不会！
7楼2014-07-23 09:23:51
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wuweifeng710

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 三蛰 at 2014-07-23 09:23:51
离完心能看到白色沉淀不？我怀疑你是在用乙醇洗脱的时候，把dna倒掉了。。。很多时候不注意就把它倒掉了。

有白色沉淀，正是感觉一切都很正常，跑出来却什么都没有，很困惑
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8楼2014-07-23 09:47:16
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wuweifeng710

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-23 02:30:05
TE溶解或RNase处理之后有测浓度么？是否正常？
TE溶液是新配制的么？pH还正常不？
你提的是植物细胞么？CTAB提出来的DNA很容易成团，不易溶解，可以试试增加溶解时间。能够看到絮状或丝状说明DNA沉淀是没问题的， ...

好的，我试试去
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9楼2014-07-23 09:49:38
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