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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 蛋白质的分离
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zhongnan1991

铜虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白质的分离已有6人参与

小弟最近最做一个蛋白（一种酶）的纯化实验，目标蛋白的分子量约40KD，主要杂蛋白的分子量约为15KD,不知道用什么方法分离。
不知道透析能不能行？如果可行应该选孔径多大的透析袋？用超滤管可行吗？ 还有过柱子怎么样？
希望能够得到有这方面经验的师兄师姐或者老师的指点，万分期待，不胜感激！

[ Last edited by silicare on 2014-7-18 at 10:53 ]
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我发如华，是念何年；夜晴如镜，郎心似铁。
1楼2014-07-18 10:24:41
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by zhongnan1991 at 2014-07-23 08:18:16
这个蛋白是从植物中提取的天然蛋白，不是经过改造加工的。我还没试，不过感觉带HIS标签的概率不大吧？...

那基本上就是不带His标签了，可以尝试一下过一下离子柱或者疏水柱什么的，这是纯化目的蛋白的常规方法
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8楼2014-07-23 13:45:03
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hitzbz

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以做凝胶层析，从分子量大小上看，G75的胶应该可以分开
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stay hungry,stay foolish----------
9楼2014-07-23 13:55:35
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yqbter: 金币+1, 鼓励发帖，欢迎常来生物科学版发帖！ 2014-07-18 14:16:00
你的目标蛋白带不带标签，比如若带His标签的话，过一下HIs柱不就可以了吗
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2楼2014-07-18 10:28:06
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elise1987

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
透析肯定是可行，透析袋25KD分子量的。超滤也可以，分子量控制在20KD以下，不然会漏。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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不折腾，不胡闹，珍惜时间和生命
3楼2014-07-18 15:35:17
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polypro

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

两个蛋白的等电点差别如何，如果有一定差别，可尝试等电点超离
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泉涸,鱼相与处于陆,相呴以湿,相濡以沫,不如相忘于江湖。
6楼2014-07-23 09:00:49
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elise1987

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zhongnan1991: 金币+5 2014-11-03 21:52:37
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhongnan1991 at 2014-07-23 12:35:40
嗯~  可是用什么做透析液呢？我用三蒸水透析，一晚之后透析袋中溶液变得澄清并产生了很多黄色的粘连沉淀物。又换了PBS做透析液，感觉有一部分溶解了，溶液变的有点儿黄，不过还是有很多的沉淀。蛋白都沉积了，肯定 ...

首先排除一下透析袋的问题，重金属残会引起变性沉淀。其次，蛋白质本身性质，清蛋白溶解性好。优球蛋白不溶于水。拟球蛋白可溶。你需要搞清楚你的蛋白溶于什么溶剂。然后用这个溶剂做透析液就可以了。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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不折腾，不胡闹，珍惜时间和生命
7楼2014-07-23 11:32:24
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uulovelyuu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

用30KD截留量的超滤浓缩管或者超滤浓缩膜就可以啊，反复几次，基本能去除，加入杂蛋白和你的蛋白间没有相互作用。这个方法比较简单。也可考虑用SUPERDEX75柱子，但我感觉超滤的方式更快捷，蛋白浓度还不会被稀释。
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13楼2014-07-23 22:32:40
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uulovelyuu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zhongnan1991: 金币+5 2014-11-03 21:52:51
引用回帖:
12楼: Originally posted by zhongnan1991 at 2014-07-23 22:15:40
我今天分别用10KD  30KD  50KD的超滤管（8000rpm   10min）离完之后跑电泳，结果：所有的管子所有的蛋白都漏下来了。 太疑惑了~~  40KD的从10KD的超滤管漏的很彻底，和没超滤管的原液比SDS-PAGE条带一点儿 ...

肯定是你的超滤管漏了，另外确认下你的转速有没有太高。注意，如果是新的超滤管，用前至少在ddH2O或者20%的乙醇里浸泡半小时，千万不要新管子拿过来直接用。这个办法原理上是没问题的。
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14楼2014-07-23 22:36:41
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zhongnan1991

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-18 10:28:06
你的目标蛋白带不带标签，比如若带His标签的话，过一下HIs柱不就可以了吗

这个蛋白是从植物中提取的天然蛋白，不是经过改造加工的。我还没试，不过感觉带HIS标签的概率不大吧？
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我发如华，是念何年；夜晴如镜，郎心似铁。
4楼2014-07-23 08:18:16
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zhongnan1991

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by elise1987 at 2014-07-18 15:35:17
透析肯定是可行，透析袋25KD分子量的。超滤也可以，分子量控制在20KD以下，不然会漏。

嗯~  可是用什么做透析液呢？我用三蒸水透析，一晚之后透析袋中溶液变得澄清并产生了很多黄色的粘连沉淀物。又换了PBS做透析液，感觉有一部分溶解了，溶液变的有点儿黄，不过还是有很多的沉淀。蛋白都沉积了，肯定会影响透析效果吧？(我用的透析袋是14KD的，因为手头只有这个，杂蛋白应该透不出来，就是想先试一下。结果就发现透析的过程中蛋白会沉积。这样还能用透析除杂蛋白吗？）
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我发如华，是念何年；夜晴如镜，郎心似铁。
5楼2014-07-23 08:35:40
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zhongnan1991

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by elise1987 at 2014-07-18 15:35:17
透析肯定是可行，透析袋25KD分子量的。超滤也可以，分子量控制在20KD以下，不然会漏。

10楼2014-07-23 16:49:48
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