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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 求助如何将蛋白和游离荧光配体分离
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farther1990

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助如何将蛋白和游离荧光配体分离 已有2人参与

用荧光配体标记蛋白，现在想要将溶于去污剂溶液的蛋白和荧光配体分离开来，请问使用哪种简便便宜的分离或过滤方式能达到这种效果？跪求，万分感谢各位的帮助与关注！

[ Last edited by farther1990 on 2014-2-12 at 10:23 ]
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不以物喜，不以己悲
1楼 2014-02-12 09:47:58
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
引用回帖:
9楼: Originally posted by farther1990 at 2014-02-13 14:39:51
离子交换操作毕竟繁琐，一批有八个浓度梯度，这样处理太费时间了。荧光配体是通过荧光素偶联上特异性结合受体的药物，我也不确定是不是共价键结合，还求高手指教，谢谢！...

除去过量小分子除了离子交换柱就是透析,要么然HPLC或者ziptip之类的吸附材料. 你可以用些小点的离子交换柱嘛,比如这种:http://www.genaxxon.net/pdf/CentriSep.pdf 只有0.5ml体积, 就在2ml EP管里做. 10分钟就完成交换.
如果就是不愿意用离子交换那可以从蛋白的tag入手,比如你蛋白上有his-tag那你就用一点点镍柱,20-40ul就够,在离心管里做个pulldown. 把挂柱的蛋白洗几次,然后再用咪唑洗脱下来.
但还是要注意的是如果你的配体不是共价键结合,在除去过量配体的同时,配体就会解离下来. 非共价键结合的,除非Kd非常小, 比如biotin-streptavidin
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farther1990
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
10楼2014-02-14 00:05:56
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wangdunzju

新虫 (小有名气)

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★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-12 13:40:45
如果配体和蛋白的分子量差距大的话，可以考虑用凝胶电泳分离，然后切胶回收。
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2楼2014-02-12 10:29:56
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farther1990

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangdunzju at 2014-02-12 10:29:56
如果配体和蛋白的分子量差距大的话，可以考虑用凝胶电泳分离，然后切胶回收。

非常感谢！因为我想测定游离的荧光配体浓度，如果是跑胶的话就不能达到这个效果。我尝试使用过10kD超滤的方法，也不能将游离配体完全离心收集。
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不以物喜，不以己悲
3楼2014-02-12 10:35:41
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wangdunzju

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-13 12:26:37
如果你的目的只是测荧光配体的浓度，查查看是不是有检测荧光信号的方法，直接检测样品中荧光物质的浓度，然后换算成配体的浓度。仅供参考。
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4楼2014-02-12 15:15:12
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wangdunzju

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-13 12:26:41
还有一个办法，根据你刚才说的目的，为了确定配体浓度，可以这样：
还是跑电泳，将蛋白与配体分离，然后根据条带染色的深浅，用软件分析，可以算出蛋白与配体条带亮度的比值，再根据分子量换算出摩尔比，这样总浓度可以测定，从而间接计算配体浓度。
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5楼2014-02-12 15:19:18
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farther1990

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wangdunzju at 2014-02-12 15:15:12
如果你的目的只是测荧光配体的浓度，查查看是不是有检测荧光信号的方法，直接检测样品中荧光物质的浓度，然后换算成配体的浓度。仅供参考。

因为直接通过荧光光谱仪检测，由于蛋白质有背景荧光，所以会有很强干扰
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不以物喜，不以己悲
6楼2014-02-12 15:56:45
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farther1990

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wangdunzju at 2014-02-12 15:19:18
还有一个办法，根据你刚才说的目的，为了确定配体浓度，可以这样：
还是跑电泳，将蛋白与配体分离，然后根据条带染色的深浅，用软件分析，可以算出蛋白与配体条带亮度的比值，再根据分子量换算出摩尔比，这样总浓度 ...

谢谢，不过实验室条件有限，没有这个软件。而且荧光配体和蛋白是可逆结合，跑胶使得蛋白变性，结合配体会游离出来，实验结果不可信哦。还是非常感谢你啊
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不以物喜，不以己悲
7楼2014-02-12 16:01:07
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-13 12:26:45
荧光和蛋白是共价键结合的吗? 如果是就用离子交换柱 G-25之类的纯化, 超滤肯定除不干净
但是如果不是共价键结合, 你在除去过量荧光配体的同时, 就会导致配体和蛋白解离. 因为本质上就是一个平衡, 如果你的配体浓度小于或接近Kd, 即便过量也会解离下来
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
8楼2014-02-12 22:55:33
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farther1990

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2014-02-12 22:55:33
荧光和蛋白是共价键结合的吗? 如果是就用离子交换柱 G-25之类的纯化, 超滤肯定除不干净
但是如果不是共价键结合, 你在除去过量荧光配体的同时, 就会导致配体和蛋白解离. 因为本质上就是一个平衡, 如果你的配体浓度 ...

离子交换操作毕竟繁琐，一批有八个浓度梯度，这样处理太费时间了。荧光配体是通过荧光素偶联上特异性结合受体的药物，我也不确定是不是共价键结合，还求高手指教，谢谢！
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不以物喜，不以己悲
9楼2014-02-13 14:39:51
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