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萝莉胖

铜虫 (小有名气)

[求助] 蛋白分离，Sephadex分子量的选择

各位大侠好，小弟用大肠杆菌表达一蛋白，his tag纯化。最后过完Ni柱，SDS-PAGE检测，有两条带，一条是目的蛋白40KD，一条是100KD的his本底蛋白。一般这种情况如何分离这两种蛋白，用Sephadex可以吗，分子量如何选择？

谢谢各位！
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我是自己的神
1楼 2012-03-23 16:49:53
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
先试一下离子交换层析柱吧，只要等电点相差1个单位，就可以分离得很好了，凝胶过滤柱也可以试一下，两个蛋白质的分子量都处于G200的分离范围内。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2012-03-24 00:12:50
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萝莉胖

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-03-24 00:12:50:
先试一下离子交换层析柱吧，只要等电点相差1个单位，就可以分离得很好了，凝胶过滤柱也可以试一下，两个蛋白质的分子量都处于G200的分离范围内。

谢谢回答
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我是自己的神
3楼2012-03-24 13:46:38
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的量有多大吧，量小的话，可以先试试凝胶过滤，如果量大的话，还是先用离子交换吧，如果你是用来摸索条件，以后有放大的可能，也从离子交换入手吧，毕竟凝胶过滤处理的量还是很少的。
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4楼2012-03-24 16:49:13
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萝莉胖

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lihuan0525 at 2012-03-24 16:49:13:
你的量有多大吧，量小的话，可以先试试凝胶过滤，如果量大的话，还是先用离子交换吧，如果你是用来摸索条件，以后有放大的可能，也从离子交换入手吧，毕竟凝胶过滤处理的量还是很少的。

量的话就几毫克，不过我看大家都说凝胶（分子筛）效果不好，推荐离子交换，555，离子交换层析木有做过，要从头看起了
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我是自己的神
5楼2012-03-28 17:38:39
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lihuan0525

金虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 萝莉胖 at 2012-03-28 17:38:39:
量的话就几毫克，不过我看大家都说凝胶（分子筛）效果不好，推荐离子交换，555，离子交换层析木有做过，要从头看起了

如果用离子交换的话，首先你要确定你的目的蛋白的等电点，选择合适的缓冲液，可能还要走梯度，总之离子交换摸索条件可能要时间长点吧。
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6楼2012-03-28 17:55:43
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mssj300130

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你随便用个离子交换的填料，然后0-1MNaCl梯度走5-10个体积，如果能出两个峰就比较有希望了，当然如果你上来试的条件就能流穿一种蛋白，那是最好不过了
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7楼2012-04-10 17:00:27
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