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zhongnan1991

铜虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白质的分离已有6人参与

小弟最近最做一个蛋白(一种酶)的纯化实验,目标蛋白的分子量约40KD,主要杂蛋白的分子量约为15KD,不知道用什么方法分离。
不知道透析能不能行?如果可行应该选孔径多大的透析袋?用超滤管可行吗? 还有过柱子怎么样?
希望能够得到有这方面经验的师兄师姐或者老师的指点,万分期待,不胜感激!

[ Last edited by silicare on 2014-7-18 at 10:53 ]
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我发如华,是念何年;夜晴如镜,郎心似铁。
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zhongnan1991

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-18 10:28:06
你的目标蛋白带不带标签,比如若带His标签的话,过一下HIs柱不就可以了吗

这个蛋白是从植物中提取的天然蛋白,不是经过改造加工的。我还没试,不过感觉带HIS标签的概率不大吧?
我发如华,是念何年;夜晴如镜,郎心似铁。
4楼2014-07-23 08:18:16
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zhongnan1991

铜虫 (初入文坛)

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3楼: Originally posted by elise1987 at 2014-07-18 15:35:17
透析肯定是可行,透析袋25KD分子量的。超滤也可以,分子量控制在20KD以下,不然会漏。

嗯~  可是用什么做透析液呢?我用三蒸水透析,一晚之后透析袋中溶液变得澄清并产生了很多黄色的粘连沉淀物。又换了PBS做透析液,感觉有一部分溶解了,溶液变的有点儿黄,不过还是有很多的沉淀。蛋白都沉积了,肯定会影响透析效果吧?(我用的透析袋是14KD的,因为手头只有这个,杂蛋白应该透不出来,就是想先试一下。结果就发现透析的过程中蛋白会沉积。这样还能用透析除杂蛋白吗?)
我发如华,是念何年;夜晴如镜,郎心似铁。
5楼2014-07-23 08:35:40
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zhongnan1991

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by elise1987 at 2014-07-18 15:35:17
透析肯定是可行,透析袋25KD分子量的。超滤也可以,分子量控制在20KD以下,不然会漏。

10楼2014-07-23 16:49:48
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zhongnan1991

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by polypro at 2014-07-23 09:00:49
两个蛋白的等电点差别如何,如果有一定差别,可尝试等电点超离

嗯~  那一个蛋白如果文献上查不到它的等电点,我该如果确定它的等电点,有简便的方法吗?
我发如华,是念何年;夜晴如镜,郎心似铁。
11楼2014-07-23 16:55:07
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zhongnan1991

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by elise1987 at 2014-07-23 11:32:24
首先排除一下透析袋的问题,重金属残会引起变性沉淀。其次,蛋白质本身性质,清蛋白溶解性好。优球蛋白不溶于水。拟球蛋白可溶。你需要搞清楚你的蛋白溶于什么溶剂。然后用这个溶剂做透析液就可以了。
...

我今天分别用10KD  30KD  50KD的超滤管(8000rpm   10min)离完之后跑电泳,结果:所有的管子所有的蛋白都漏下来了。 太疑惑了~~  40KD的从10KD的超滤管漏的很彻底,和没超滤管的原液比SDS-PAGE条带一点儿都不淡
我发如华,是念何年;夜晴如镜,郎心似铁。
12楼2014-07-23 22:15:40
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