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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 蛋白质的分离
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zhongnan1991

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by polypro at 2014-07-23 09:00:49
两个蛋白的等电点差别如何，如果有一定差别，可尝试等电点超离

嗯~  那一个蛋白如果文献上查不到它的等电点，我该如果确定它的等电点，有简便的方法吗？
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我发如华，是念何年；夜晴如镜，郎心似铁。
11楼2014-07-23 16:55:07
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zhongnan1991

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by elise1987 at 2014-07-23 11:32:24
首先排除一下透析袋的问题，重金属残会引起变性沉淀。其次，蛋白质本身性质，清蛋白溶解性好。优球蛋白不溶于水。拟球蛋白可溶。你需要搞清楚你的蛋白溶于什么溶剂。然后用这个溶剂做透析液就可以了。
...

我今天分别用10KD  30KD  50KD的超滤管（8000rpm   10min）离完之后跑电泳，结果：所有的管子所有的蛋白都漏下来了。 太疑惑了~~  40KD的从10KD的超滤管漏的很彻底，和没超滤管的原液比SDS-PAGE条带一点儿都不淡
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我发如华，是念何年；夜晴如镜，郎心似铁。
12楼2014-07-23 22:15:40
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uulovelyuu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

用30KD截留量的超滤浓缩管或者超滤浓缩膜就可以啊，反复几次，基本能去除，加入杂蛋白和你的蛋白间没有相互作用。这个方法比较简单。也可考虑用SUPERDEX75柱子，但我感觉超滤的方式更快捷，蛋白浓度还不会被稀释。
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13楼2014-07-23 22:32:40
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uulovelyuu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zhongnan1991: 金币+5 2014-11-03 21:52:51
引用回帖:
12楼: Originally posted by zhongnan1991 at 2014-07-23 22:15:40
我今天分别用10KD  30KD  50KD的超滤管（8000rpm   10min）离完之后跑电泳，结果：所有的管子所有的蛋白都漏下来了。 太疑惑了~~  40KD的从10KD的超滤管漏的很彻底，和没超滤管的原液比SDS-PAGE条带一点儿 ...

肯定是你的超滤管漏了，另外确认下你的转速有没有太高。注意，如果是新的超滤管，用前至少在ddH2O或者20%的乙醇里浸泡半小时，千万不要新管子拿过来直接用。这个办法原理上是没问题的。
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14楼2014-07-23 22:36:41
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elise1987

金虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by zhongnan1991 at 2014-07-24 02:15:40
我今天分别用10KD  30KD  50KD的超滤管（8000rpm   10min）离完之后跑电泳，结果：所有的管子所有的蛋白都漏下来了。 太疑惑了~~  40KD的从10KD的超滤管漏的很彻底，和没超滤管的原液比SDS-PAGE条带一点儿 ...

不应该啊，超滤管质量没问题的吧？一般来说选择截留分子量为样品一半的膜是不会漏，至少不会全漏。楼主可以考虑一下中空纤维过滤或者膜包。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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不折腾，不胡闹，珍惜时间和生命
15楼2014-07-23 22:42:30
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polypro

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by zhongnan1991 at 2014-07-23 16:55:07
嗯~  那一个蛋白如果文献上查不到它的等电点，我该如果确定它的等电点，有简便的方法吗？...

有序列的话可自接算出来，有结构更准确
否则可测一条酸碱滴定曲线可测定等电点
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泉涸,鱼相与处于陆,相呴以湿,相濡以沫,不如相忘于江湖。
16楼2014-07-24 08:22:10
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白话八股

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

用30KD的超虑管？可以吧？

[ 发自小木虫客户端 ]
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最爱的那个人会出现在身边。
17楼2014-07-24 08:32:52
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